重组核心蛋白聚糖转染对HepG2细胞周期、凋亡以及P21表达的影响

目的将已构建完成的分泌型核心蛋白聚糖(DCN)真核表达载体转染到HepG2中并检测其表达同时研究其抗肿瘤作用的机制。方法脂质体介导分泌型DCN真核表达载体转染HepG2细胞,经G418筛选建立稳定转染的细胞株,采用RT-PCR、免疫组化检测其表达。MTT检测细胞增殖活力,流式细胞仪分析细胞周期,RT-PCR方法检测P21WAF1/CIP1mRNA表达情况。结果RT-PCR可见转染组细胞DCN mRNA表达明显增多,免疫组化可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高。细胞生长曲线显示转染组细胞生长缓慢;G1期细胞显著增多;P21WAF1/CIP1mRNA表达增高。结论本研究成功建立稳定转染DCN的HepG2细胞株,证实DCN通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和提高P21WAF1/CIP1蛋白抑制HepG2的生长。

p21基因转染人肝癌SMMC-7721细胞对化疗药物敏感性的研究

目的探讨p21基因转染人肝癌SMMC-7721细胞（7721细胞）对化疗药物的敏感性，深入研究p21基因对肝癌细胞的治疗作用。方法应用磷酸钙介导p21基因转染人肝癌7721细胞；通过G418筛选稳定表达细胞株并扩大培养；采用MTT法检测肿瘤细胞增殖速度；流式细胞术检测细胞周期变化。结果经过3～4w G418筛选得到稳定表达的细胞株，p21基因稳定转染并联合化疗药物应用可明显抑制7721细胞的体外增殖，细胞周期明显改变，细胞从G1期到G2期发生阻滞。结论提示转染外源p21基因联合化疗药物可使7721细胞周期阻滞于G1期，并可抑制肿瘤细胞增殖。

转染P21 WAF1基因对BT-325细胞端粒酶表达的影响

目的 :观察外源性p2 1WAF1基因对BT - 32 5细胞的作用 ,探讨p2 1WAF1表达水平的改变对细胞端粒酶活性的影响。方法 :经脂质体介导的方法将PCEP -WAF1质粒导入BT - 32 5细胞中 ,细胞克隆转移扩大培养后 ,采用TRAP -PCR -ELISA、TUNEL和电镜等技术检测外源性p2 1WAF1基因对BT - 32 5细胞端粒酶活性和细胞凋亡的作用。结果 :较对照组相比 ,转染外源性p2 1WAF1基因的BT - 32 5细胞端粒酶表达水平显著下降 ,伴有显著细胞凋亡现象。结论 :外源性p2 1WAF1基因的表达可促进BT - 32 5细胞端粒酶活性降低 ,诱发细胞显著凋亡。提示端粒酶的活性表达可能与细胞周期调控存在密切联系。

p53p21双基因转染对肝癌细胞生长的抑制作用研究

目的 研究 p5 3和 p2 1双基因对肝癌细胞的联合基因治疗效果。 方法 通过磷酸钙 -DNA共沉淀法将p5 3和 p2 1双基因真核共表达载体及单基因表达载体引入肝癌细胞SMMC 772 1,用直接镜检 ,DNAladder检测法和四甲基偶氮唑 (MTT)法等研究细胞生长情况。结果 转染外源 p5 3p2 1双基因的肝癌细胞SMMC 772 1与未转染及单基因转染的肝癌细胞SMMC 772 1相比 ,其增殖速度显著下降。结论 p5 3和p2 1双基因对肝癌细胞的联合基因治疗效果比较明显 ,对肝癌基因治疗的进一步研究具有指导意义。

转染野生型p53基因介导的HL-60细胞凋亡与p21蛋白表达的关系

目的 :探讨野生型p5 3基因对HL - 6 0细胞的作用机制 ,并检测p2 1的表达 ,探讨二者在白血病中的关系。方法 :用脂质体介导的方法将野生型p5 3基因导入p5 3基因严重缺失的人髓细胞白血病细胞系HL - 6 0中 ,用形态学 ,电镜 ,流式细胞仪 ,间接免疫荧光等方法检测p5 3对HL - 6 0细胞的促凋亡作用及对p2 1表达的调节作用。结果 :野生型p5 3基因能促进HL - 6 0细胞凋亡及上调p2 1表达。结论 :p2 1可能在p5 3促HL - 6

反义p21^(WAF1/CIP1)基因转染对肾癌细胞凋亡抑制作用的影响

目的 探讨 p2 1WAF 1 /CIP1基因在顺铂诱导的 GRC- 1肾癌细胞凋亡过程中的作用 .方法 使用脂质体转染方法将正义 p2 1WAF 1 /CIP1基因及反义 p2 1WAF 1 /CIP1基因分别导入 GRC- 1肾癌细胞系中 ,对所获转染细胞进行形态学观察和流式细胞仪检测 .结果 在正义 p2 1WAF 1 /CIP1基因转染后 GRC- 1肾癌细胞中 ,顺铂诱导细胞凋亡的作用增强 ;在反义 p2 1WAF 1 /CIP1基因转染后 GRC- 1肾癌细胞中 ,顺铂诱导细胞凋亡的作用受到抑制 .结论 在 GRC- 1肾癌细胞中 ,顺铂诱导的细胞凋亡至少部分是通过 p2 1WAF 1 /CIP1基因发挥作用 .p2 1WAF 1

转染P21^(WAF1)基因对GRC—1肾癌细胞凋亡的影响

目的:建立GRC—1肾癌细胞凋亡模型并探讨P21WAF1基因对肾癌细胞凋亡的影响。方法:采用顺铂诱导法建立肾癌细胞凋亡模型及转染P21WAF1基因方法观察P21WAF1基因的作用。结果:①用20μmol顺铂诱导GRC—1肾癌细胞。建立了细胞凋亡模型,凋亡细胞占细胞总数为29.4％。②成功转染了P21WAF1基因至GRC—1肾癌细胞;③转染P21WAF1基因的GRC—1肾癌细胞,培养至第10代细胞加入20μmol顺铂后,凋亡细胞占细胞总数为75.6％。④凋亡细胞比率29.4％与75.6％之间存在显著性差异,P<0.01。结论:①成功建立了肾癌细胞凋亡模型;②转染P21WAF1基因对肾癌细胞凋亡有促进作用。

转染p21^(WAF1)基因降低K562细胞对VP-16的敏感性

为探讨p2 1WAF1对K5 6 2细胞药物敏感性的调节作用及其对VP 16诱导的K5 6 2细胞凋亡的影响 ,构建了p2 1WAF1逆转录病毒表达载体 ,体外转染白血病细胞系K5 6 2。经RT PCR和Western印迹检测得到稳定表达p2 1WAF1的K5 6 2 p2 1WAF1细胞克隆后 ,用MTT法和存活细胞计数法检测转染 p2 1WAF1的K5 6 2细胞对VP 16在剂量和作用时间上的敏感性变化 ,用DNA凋亡片段分析和流式细胞术检测其对VP 16诱导的K5 6 2细胞凋亡的影响。实验结果显示 ,外源性 p2 1WAF1的表达明显降低了VP 16诱导的K5 6 2细胞凋亡 ,降低了K5 6 2细胞对VP 16的敏感性。以上结果表明 ,p2 1WAF1能通过抑制K5 6 2细胞的凋亡来降低其对VP 16的敏感性。

MPC_(30)-DEA_(70)载microRNA-21AS-ODN转染心肌成纤维细胞的可行性分析

目的探讨阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70能否成功载microRNA-21反义寡核苷酸(AS-ODN)转染大鼠心肌成纤维细胞,以及转染后MPC30-DEA70/microRNA-21ODN复合物对大鼠心肌成纤维细胞microRNA-21的基因沉默效应和microRNA-21下游产物的抑制作用。方法制备不同氨基与磷酸根比值(N∶P)的MPC30-DEA70/microRNA-21ODN复合物;差速贴壁法分离大鼠心肌成纤维细胞并培养;利用荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜观察MPC30-DEA70/microRNA-21ODN复合物(FAM标记)在细胞内的分布;采用Western blotting法和RT-PCR法分别检测细胞外调节激酶(ERK)-丝裂原活化蛋白(MAP)激酶、Ⅰ型胶原蛋白及pre-microRNA-21的表达。结果原代培养的大鼠心肌成纤维细胞光镜下呈三角形或不规则多边形,核居中;MPC30-DEA70/microRNA-21ODN复合物在心肌成纤维细胞中具有较高的转染率,且呈剂量依赖性(P均<0.05),共聚焦激光扫描显微镜示复合物大部分分布于核周,少部分进入细胞核;MPC30-DEA70载microRNA-21ODN进入心肌成纤维细胞后下调pre-microRNA-21、ERK-MAP激酶及Ⅰ型胶原蛋白的表达(P均<0.05)。结论 MPC30-DEA70能成功并有效转载microRNA-21ODN进入心肌成纤维细胞,使microRNA-21及其下游信号通路ERKMAP激酶、Ⅰ型胶原蛋白表达下调,是一种有效的转基因载体。

外源性p21^(waf1)基因转染对人胃癌细胞系BGC-823增殖的影响

目的:探讨外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖的影响。方法:用脂质体介导的方法将pIRES-p21waf1真核表达载体转染人胃癌细胞系BGC-823,分为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组及未转染组三个组别。应用实时荧光定量RT-PCR、Westernblot免疫印迹分别在基因和蛋白两个水平检测各组p21的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖能力,流式细胞仪分析细胞DNA周期变化,所有数据进行统计学分析。结果:p21waf1转染组p21waf1mRNA和p21蛋白高表达(P<0.01);p21waf1转染组BGC-823细胞生长速度明显低于空载体组和未转染组(P<0.01);流式细胞仪观察到p21waf1转染组细胞的G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(P<0.01),S期比例显著低于空载体组和未转染组(P<0.01),并出现凋亡峰。结论:p21waf1基因转染可以抑制人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡,可能为胃癌的基因治疗提供一条新的途径。

转染p21基因对人宫颈癌Hela细胞的影响

目的研究转染p21基因对人宫颈癌Hela细胞的抑制及凋亡影响。方法用Lipofectamine 2000脂质体介导,将质粒pcDNA3.1(+)-p21基因转入人宫颈癌Hela细胞株;免疫组化法检测转染p21基因后,其编码蛋白在Hela细胞的表达情况;描绘p21基因转染后Hela细胞的增殖曲线;WST-1法测定OD值,计算细胞生长抑制率及流式细胞仪检测p21基因转染对Hela细胞的凋亡影响。结果免疫组化法显示p21基因转染后在Hela细胞的胞核内高表达;p21基因的表达可抑制Hela细胞的体外生长,且Hela/p21细胞的生长曲线较对照组明显降低;WST-1法显示Hela/p21的细胞活力与对照组相比有显著性差异(P<0.05);流式细胞仪检测显示转染p21基因的Hela细胞凋亡率显著高于对照组,约20%以上。结论转染p21基因对Hela细胞具有明显的抑制和诱导凋亡作用。

转染p21基因对人动脉平滑肌细胞的影响

目的:探讨转染p21基因对人动脉平滑肌细胞(HASMC)的影响,以探讨转染p21基因实现抗冠状动脉支架内再狭窄的作用,为冠状动脉支架内再狭窄的治疗提供新思路。方法:以Lipo-fectamine 2000脂质体介导p21基因转染HASMC株;免疫组化法检测转染p21基因后,其编码蛋白在HASMCs的表达情况;描绘p21基因转染后HASMCs的增殖曲线;WST-1法测定OD值,计算细胞生长抑制率及流式细胞仪检测p21基因转染对HASMCs凋亡的影响。结果:免疫组化法显示p21基因成功转入HASMCs后,其编码的蛋白能在细胞核内进行高表达;转染p21基因的HASMCs在体外生长曲线较对照组明显降低;WST-1法显示转染p21基因的HASMCs细胞活力与对照组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测发现转染p21基因的HASMCs细胞凋亡率达40.26%+0.013%,且显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功将p21基因转入HASMCs,其编码蛋白可能参与了抑制细胞生长和诱导细胞凋亡作用,提示p21基因转染HASMCs技术有可能为人冠状动脉支架内再狭窄的治疗提供一种新的防治策略与手段。

猪带绦虫AgB与猪CD58或IFN-γ共表达质粒的构建及其在BHK-21细胞中的表达

猪囊尾蚴病是一种重要的人畜共患病,研制有效、安全、廉价的疫苗是当前主要的研究方向之一。本试验通过PCR方法,从含猪囊尾蚴B抗原(AgB)、猪CD58和猪IFN-γ的重组克隆质粒中扩增出AgB、CD58和IFN-γ基因,然后将其克隆到真核表达载体pBudCE4.1中。重组表达质粒鉴定后,在脂质体作用下转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)或直接免疫荧光试验分别检测AgB、CD58和IFN-γ在BHK-21中的表达。结果显示,AgB、CD58和IFN-γ在BHK-21细胞中都成功表达,这为研制抗猪囊尾蚴DNA疫苗奠定了坚实基础。

TGF-β1基因转染对人晶状体上皮细胞周期调控的影响

目的:探讨脂质体介导的TGF-β1基因(pEGFP-TGF-β1)转染诱导人晶状体上皮细胞系-B3(HLEC-B3)细胞周期蛋白激酶抑制因子p21及细胞周期蛋白激酶CDK2的表达及其对细胞周期调控的影响。方法:将pEGFP-TGF-β1转染人晶状体上皮细胞系-B3(HLEC-B3),采用RT-PCR和Western-blot方法检测pEGFP-TGF-β1转染后24,48,72,96hp21,CDK2和Smad4mRNA和蛋白的表达,设立正常细胞组及pEGFP-C2转染组为对照组。结果:pEGFP-TGF-β1转染组TGF-β124h开始升高,48h达到最高,72h略有减少,96h明显减少,但仍高于正常组,而空载体组与正常细胞组则无明显变化。p21变化趋势和TGF-β1相符,CDK2组变化趋势则正好相反,Smad4组48h明显升高,72h下降明显,96h基本恢复正常。结论:TGF-β1通过活化凋亡基因p21,降低细胞周期蛋白激酶CDK2。

超声微泡介导质粒转染对人肝癌HepG2细胞迁移、侵袭及克隆能力的影响

目的探讨超声微泡造影剂介导miRNA质粒转染人肝癌HepG2细胞后迁移、侵袭及克隆能力的改变。方法在前期实验所筛选的最佳超声微泡转染条件下,转染目的基因反义miR-21/221、miR-199a进入人肝癌HepG2细胞,划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆能力。结果转染目的质粒后,细胞的迁移、侵袭能力及克隆能力与对照组比较均显著受到抑制(P<0.05),其中以miR-199a质粒组的抑制效果最佳(相对细胞迁移率31.05%;平均视野侵袭细胞数38.67±4.51;克隆数105.67±5.86),与其它目的质粒组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过分析miRNAs对人肝癌HepG2细胞部分细胞功能的影响,为肝癌的基因治疗提供新的靶点及思路。

FGF21过表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡

目的 探讨成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因过表达对人胰腺癌细胞株PANC-1凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响。方法 将含FGF21基因序列的重组慢病毒载体FGF21-3xflag-ZsGreen-PURO和空载体HBLV-ZsGreen-PURO感染人胰腺癌PANC-1细胞,采用Western blot和RT-qPCR检测过表达FGF21的PANC-1细胞中FGF21、Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9蛋白和FGF21、肿癌坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的mRNA表达,流式细胞仪检测过表达FGF21的PANC-1细胞的凋亡,CCK-8法检测其增殖能力,划痕愈合实验和Transwell实验检测其迁移和侵袭能力。结果 HBLV-h-FGF21-3xflag-ZsGreen-PURO转染人胰腺癌细胞株PANC-1后,FGF21蛋白表达水平较空载体感染组升高,凋亡蛋白Caspase3、Cleavedcaspase3、Caspase9蛋白的表达水平均升高(P均<0.01);FGF21的mRNA表达水平较空载体感染组升高,且TNF-α和IL-6的mRNA表达水平降低(P均<0.01);FGF21过表达后可增加吉西他滨诱导的胰腺癌细胞株PANC-1凋亡率,增殖、迁移和侵袭能力均降低(P均<0.01)。结论 FGF21可抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡。

转染ELF5mRNA对子宫内膜癌细胞凋亡及周期的影响

目的:检测人子宫内膜癌Ishikawa细胞转染pc DNA3.1-ELF5+EGFP后ELF5基因的表达,并观察其对Ishikawa细胞凋亡情况及周期变化的影响。方法:通过脂质体介导的方法将pc DNA3.1-ELF5+EGFP真核细胞表达载体体外转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞,设立实验组(转染pc DNA3.1-ELF5+EGFP真核载体)、空质粒组(转染pc DNA3.1-EGFP空载体)、空白对照组(未经转染的Ishikawa细胞)。体外实验:用qRT-PCR法检测子宫内膜癌Ishikawa细胞中ELF5mRNA的表达情况,MTT法检测ELF5mRNA对Ishikawa细胞增殖的影响,流式细胞仪检测三组细胞周期及凋亡情况,Western blot法检测三组肿瘤组织的细胞周期调控蛋白P21及凋亡调控因子Caspase-3表达情况的变化。体内实验:将三组细胞分别接种于NOD/SCID雌性裸鼠,观察肿瘤生长情况及测定成瘤能力,应用TUNEL法检测三组肿瘤组织细胞凋亡的情况,采用蛋白印迹法检测三组肿瘤组织的细胞周期调控蛋白P21及凋亡调控因子Caspase-3表达情况的变化。结果:重组质粒pc DNA3.1-ELF5+EGFP成功转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞;重组质粒组细胞ELF5mRNA的表达明显高于空质粒组及空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);重组质粒组各时间点的细胞增殖能力较较其他两组明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);重组质粒组G_0/G_1期的细胞比例均高于空质粒组及空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);重组质粒组细胞凋亡率分别与空质粒组及空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);重组质粒组细胞中P21及Caspase-3的表达明显高于空质粒组及空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。重组质粒组裸鼠体内的成瘤能力(瘤组织最大直径、重量)明显低于空质粒组及空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);重组质粒组裸鼠体内瘤组织细胞凋亡率分别与空质粒组及空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);(9)重组质粒组裸鼠体内瘤组织P21及Caspase-3的表达明显高于空质粒组及空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:ELF5基因可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖,将细胞周期阻滞于G_0/G_1期,并诱导其凋亡,其机制可能与P21及Caspase-3有关。

口蹄疫病毒P1+2A基因在BHK–21细胞中的表达

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDVP1+2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口蹄疫阳性血清所识别而且具有良好的生物学活性。这一结果的取得,为进一步研制新型口蹄疫基因工疫苗及其配套诊断试剂奠定了基础。

miR-21慢病毒载体构建及对骨髓间充质干细胞凋亡的影响

背景:骨髓间充质干细胞移植后凋亡成为治疗化疗性卵巢早衰效果欠佳的主要原因。miR-21参与细胞增殖与凋亡的调控,有重要的抗凋亡作用。目的:构建miR-21慢病毒载体并感染骨髓间充质干细胞,观察其对化疗药物磷酰胺氮芥诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的影响。方法:构建携带miR-21基因慢病毒表达载体LVX-shRNA2-rno-miR-21-5p,双酶切及基因测序鉴定证实载体构建成功。对载体进行包装、测定病毒滴度。将慢病毒颗粒以不同感染复数(20和40)感染骨髓间充质干细胞,检测感染效率,使用real-time PCR法检测骨髓间充质干细胞中miR-21的表达。流式细胞仪、Hoechst33342染色检测骨髓间充质干细胞在磷酰胺氮芥模拟的化疗微环境中的凋亡率。结果与结论:(1)成功构建miR-21慢病毒载体,病毒滴度约为6×10^(11) CFU/L;(2)载体转染骨髓间充质干细胞效率达90%以上;(3)miR-21组1(感染复数为20)、miR-21组2(感染复数为40)miR-21表达量明显高于骨髓间充质干细胞组及空载组(P=0.000);(4)转染组骨髓间充质干细胞的凋亡率、凋亡指数均低于空载组及骨髓间充质干细胞组(P=0.001);(5)实验成功构建大鼠miR-21慢病毒载体系统,miR-21上调能抑制骨髓间充质干细胞凋亡,促进细胞增殖。

p21Cip1基因对V_(79-8)细胞周期的影响

为了探讨缺乏可测出Ｇ１、Ｇ２期Ｖ７９－８细胞株的细胞周期失调的分子机理，构建了人的周期负调控基因ｐ２１Ｃｉｐ１的可表达重组质粒ｐＸＪＳＣ，转染该细胞系，建立了高表达ｐ２１的Ｖ７９－８－ＳＣ细胞。以３ＨＴｄＲ放射自显影法，流式细胞光度术，细胞增殖曲线测定及免疫印迹技术，检测及比较了与细胞周期变化和增殖有关基因的表达，发现该细胞较对照细胞Ｖ７９－８－ｎｅｏＧ１期明显延长，Ｇ２期也稍有增加。与此同时，Ｇ１期调控的ｃｙｃｌｉｎＤ１、ＣＤＫ４、Ｉｄ基因表达明显下降，Ｇ２期调控基因ｃｙｃｌｉｎＢ１的表达也有所下降。结果表明：此细胞系的细胞周期缺陷可能由于ｐ２１Ｃｉｐ１。