稳定表达鸡ST3GALⅠ基因BHK-21细胞株的建立

筛选稳定表达鸡ST3GalⅠ基因的BHK-21细胞株,为进一步研究禽流感病毒大规模细胞培养生产疫苗奠定基础。克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒pcDNA3.1-EGFP中构建重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3GaⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染BHK-21细胞后,ST3GalⅠ基因在细胞中稳定表达,经G418抗性和RT-PCR筛选鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将H9亚型禽流感病毒和H5N1Re-5禽流感病毒按不同比例接种BHK-21-ST3GalⅠ细胞和空白BHK-21细胞,同时设普通胰酶和TPCK-胰酶对照组以检测BHK-21-ST3GalⅠ细胞对H9亚型禽流感病毒和H5N1Re-5禽流感病毒的增殖效果。接毒72h后收获细胞液,常规方法测定血凝素(HA)滴度。通过在BHK-21细胞中稳定表达ST3GalⅠ基因,提高BHK-21细胞表面SAα-2,3Gal受体丰度连续传6代后仍然能检测到其表达,荧光显微镜下能看到绿色荧光,RT-PCR可检出1 029bp的目的条带。结果显示,BHK-21-ST3GalⅠ细胞在接毒量为2%时HA滴度达到1∶256,显著高于空白BHK-21细胞组,表明其更适于流感病毒的增殖,具备生产流感病毒疫苗的潜力。

稳定表达鸡ST3GalⅠ的BHK-21细胞株的构建及禽流感病毒的增殖

克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达载体pcDNA3.1-EGFP中构建真核表达质粒,转染BHK-21细胞后,通过G418抗性和绿色荧光蛋白标记双重筛选,鉴定1株表达ST3GalⅠ阳性的单克隆细胞株,绿色荧光丰富。经流式细胞仪检测,BHK-21-ST3GalⅠ细胞株中α-2,3连接型受体丰度较亲代BHK-21细胞显著提高。连续传5代10代后仍能检测到其表达,表明ST3GalⅠ基因在细胞中稳定表达。为了检测BHK-21-ST3GalⅠ细胞对H9亚型流感病毒和H5N1Re-5病毒的增殖效果,将H9亚型流感病毒和H5N1Re-5病毒接种BHK-21-ST3GalⅠ细胞和BHK-21细胞,同时设普通胰酶和TPCK-胰酶对照组。接毒72h后收获细胞液,常规方法测定血凝素(HA)滴度。试验结果表明,BHK-21-ST3GalⅠ细胞中禽流感病毒的HA滴度达到1∶256,显著高于BHK-21细胞组,表明其更适于流感病毒的增殖,具备生产流感病毒疫苗的潜力。