BHK-21细胞规模化培养鸡新城疫病毒工艺的研究和初步应用

为了实现鸡新城疫病毒HN2018株(基因Ⅶ型)在乳仓鼠肾(BHK-21)细胞上的无血清规模化培养,本试验采用悬浮培养技术驯化和筛选了1株能够稳定传代的BHK-21-xh悬浮细胞株;使用该细胞以初始密度为100×10^(4)个/mL接种摇瓶进行培养,并对摇瓶培养鸡新城疫病毒HN2018株的接毒细胞密度、培养温度、接毒量、收毒时间等工艺参数进行摸索和优化;利用摇瓶优化的病毒培养工艺,在10和100 L生物反应器中逐级放大培养BHK-21-xh悬浮细胞,接种鸡新城疫病毒;采用生物反应器悬浮培养的鸡新城疫病毒HN2018株细胞毒与鸡胚毒分别制备成灭活疫苗,免疫SPF鸡进行免疫效力的比较。结果显示,在摇瓶中培养72 h细胞密度均不低于800×10^(4)个/mL,细胞活率均不低于96%;按照BHK-21-xh细胞密度不低于800×10^(4)个/mL,病毒感染复数(MOI)为0.216进行接毒,同时添加终浓度为20μg/mL的胰蛋白酶,于35℃温度条件下培养64~72 h收获病毒液,鸡新城疫悬浮培养细胞毒红细胞凝集(HA)效价最高能够达到10log 2。在生物反应器中接种鸡新城疫病毒,其HA效价均能达到10log 2。细胞苗与鸡胚苗免疫效力相当,攻毒后均能获得100%保护,且免疫血清红细胞凝集抑制(HI)抗体效价均远高于新城疫国家标准。结果表明,应用细胞无血清全悬浮培养技术规模化培养鸡新城疫病毒HN2018株,生产工艺稳定,获得的抗原效价和纯度高,制备的灭活疫苗免疫效力良好,能够应用于新城疫疫苗的规模化生产。

BHK-21细胞中猪乙型脑炎病毒动态增殖的研究

为了研究猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)在仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)中的增殖情况,试验首先建立了实时荧光定量PCR方法,并检测该方法的敏感性、特异性和重复性,然后利用建立的实时荧光定量PCR方法和病毒半数组织感染量(TCID_(50))方法测定并比较猪JEV在BHK-21细胞中的增殖规律。结果表明:建立的猪JEV实时荧光定量PCR检测方法的扩增效率为99.3%,敏感性、特异性和重复性良好,检测敏感性可以达到1.0×10^(1)copies/μL;TCID_(50)方法测定的细胞悬液和细胞培养上清液中的病毒含量分别为1.0×10^(5.44)TCID_(50)/0.1 mL和1.0×10^(4.86)TCID_(50)/0.1 mL,实时荧光定量方法测定的病毒粒子数量分别为1.0×10^(7.50)copies/μL和1.0×10^(5.60)copies/μL,两种方法在细胞悬液中出现峰值的时间为感染病毒后60小时,在细胞培养上清液中为72小时。说明猪JEV在BHK-21细胞中增殖的最佳收毒时间是感染病毒后60小时。

稳定表达犬瘟热病毒细胞受体SLAM的BHK-21/SLAM细胞系的建立

为建立稳定表达犬瘟热病毒(CDV)受体,即信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的BHK-21细胞系,本研究将重组表达质粒pDisplay-SLAM转染于BHK-21细胞,通过G418压力筛选并结合有限稀释法、免疫荧光、RT-PCR和western blot筛选出稳定表达SLAM的阳性细胞(BHK-21/SLAM)。病毒感染试验结果显示,CDV在BHK-21细胞中无细胞病变(CPE)产生,而感染BHK-21/SLAM细胞12 h后即可出现CPE;BHK-21/SLAM细胞培养物上清液中的CDV核酸含量于24 h达到最高值(107.9拷贝/μL),明显高于对照组BHK-21细胞培养物上清液中的核酸含量(106.28拷贝/μL)。研究结果表明,与BHK-21细胞相比较,CDV在BHK-21/SLAM细胞中的病毒核酸含量更高,并能够产生明显的CPE。该细胞系的建立在CDV的分离、生物学特性研究和疫苗毒生产等方面具有良好应用前景。

羊口疮病毒ORF129基因重组质粒的构建及其在BHK-21细胞中的表达

为研究羊口疮病毒(ORFV)ORF129基因编码的锚蛋白调节宿主天然免疫应答的作用机制,利用PCR技术对ORFV/QH01/2010分离株ORF129基因进行扩增,并连接到pGEM-T easy载体,构建pGEM-ORF129重组质粒,双酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-ORFV-ORF129真核表达质粒,经酶切、PCR鉴定及测序正确后转染BHK-21细胞,观察其在细胞中的表达情况.结果表明:ORFV ORF129基因在BHK-21细胞中获得稳定表达,并为进一步研究其编码蛋白在ORFV感染过程中的分子机制奠定了基础.

逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞(BHK-21)。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。

Asia 1型FMDV感染BHK-21细胞差异蛋白质点2-DE分析

为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21细胞后蛋白质组的变化及差异,将FMDV接种于培养的单层BHK-21细胞,同时设未接毒的BHK-21细胞作对照组。待细胞病变后分别提取2组细胞总蛋白借助2-DE技术及PDQuest8.0软件进行细胞蛋白质组二维电泳图谱差异性分析。结果显示感染组有1 457个可见蛋白质点,而对照组可见的蛋白质点为1 427个。感染组蛋白点的表达量与对照组相比,二者具有统计学差异(P<0.05)的蛋白质点472个,其中表达上调251个点,表达下调221个点,新合成蛋白点30个。结果表明FMDV感染BHK-21细胞后引起了细胞蛋白质组表达模式的改变,这种变化是病毒与细胞相互作用的结果。本研究首次利用蛋白质组学技术研究Asia 1型FMDV感染BHK-21细胞后蛋白质组学差异,有助于深入研究Asia 1型FMDV和BHK-21细胞相互作用的分子机制。

BHK-21细胞稳定测定猪乙型脑炎病毒半数细胞感染量效价(TCID_(50))的条件优化及应用

为建立BHK-21细胞测定乙型脑炎病毒(Japenese encephalitis virus,JEV)病毒效价的方法,对96孔细胞板中不同初始接种量BHK-21细胞在多种维持液中的生长状态进行探讨,发现当BHK-21细胞以1250～2500个/孔接种96孔板培养24 h后,更换含3%新生牛血清的DMEM后在37℃、5%CO2条件下可至少良好维持72～96 h。在此条件下并基于Reed-Muench法测定病毒效价的原理,本文建立了准确测定JEV TCID50的方法,利用该方法对JEV野毒分离株及商品疫苗进行测定,均获得稳定、准确的病毒效价。本实验为JEV的体外培养、病毒定量、疫苗评价等提供了一种准确、稳定、易判定的参考方法。

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒(PRV)敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID_(50)病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10~6cells·mL^(-1)、搅拌转速120 r·min^(-1)、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达(7.61±0.18)×10~6 cells·mL^(-1)、细胞活率为(96.93±1.18)%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10~6cells·mL^(-1)、搅拌转速80 r·min^(-1),5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值(7.13±0.11)lgTCID_(50)·mL^(-1)。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。

稳定表达山羊SLAM受体的BHK-21细胞系的建立及应用

信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。

辛德毕斯病毒在BHK-21细胞中繁殖过程的研究

辛德毕斯病毒(Sindbis virus)在 BHK-21细胞中繁殖的一步生长曲线表明,病毒感染后2小时便可产生大量的子代病毒;感染后6小时,病毒滴度达到最高峰,为10~9TCID_(50)/ml。电镜技术显示了病毒粒子的形态结构与形态发生过程。本文还对 SbV 的代谢合成动态及对宿主细胞的影响进行了研究和讨论。

用乙基环丙沙星重建受猪鼻支原体污染的BHK-21细胞的研究

为重建受猪鼻支原体人为污染的BHK-21细胞,本研究采用含10mg/L乙基环丙沙星的培养液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理,并用DNA荧光染色法和PCR法对处理进行全程监测。结果发现,4次循环处理并再传3代后,猪鼻支原体污染已被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受支原体污染的细胞提供了参考。

稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系的建立

为建立能稳定表达T7RNA聚合酶(T7RNAP)的BHK-21细胞系以研究RNA重组疫苗,本研究从BL21(DE3)大肠杆菌中扩增T7 RNAP基因,定向克隆于质粒pcDNA3.1(+)中,经双酶切及测序鉴定,获得阳性重组质粒pcDNA3.1-T7 RNAP。用该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选14d后获得阳性细胞株。RT-PCR和western blot检测结果表明,建立了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系,并且在不同代次的阳性细胞中能稳定表达目的基因和蛋白,该研究为RNA病毒感染性质粒在细胞内转录及病毒拯救技术平台的建立奠定了基础。

山羊痘病毒诱导BHK-21细胞凋亡的检测

为验证山羊痘病毒诱导BHK-21细胞出现凋亡现象的存在,分别采用HE染色、凋亡试剂盒检测、流式细胞仪检测和DNA Ladder检测,对山羊痘病毒感染的BHK-21细胞培养物进行细胞凋亡检测。不同方法检测结果均显示,山羊痘病毒感染BHK-21细胞组相同时间细胞凋亡数明显高于对照组。表明山羊痘病毒可诱导BHK-21细胞发生凋亡。

用乙基环丙沙星重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞

为重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞,本研究采用药物乙基环丙沙星,先测出该药对大肠杆菌的最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),再测出该药对BHK-21细胞的MIC,从而确定10mg/L为乙基环丙沙星不影响细胞生长,又能抑制大肠杆菌的安全浓度。然后用含该浓度乙基环丙沙星的MEM生长液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理。经过3次循环处理,再传3代后,确认大肠杆菌污染已经被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受细菌污染的细胞提供了参考。

猪乙脑病毒分离株BSF．ZZ-1和BSF．ZZ-3在BHK-21细胞上的传代培养及E基因序列稳定性分析

为研究猪乙脑病毒(JEV)分离株遗传基因的稳定性,将JEV分离株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21细胞上进行连续传代培养,并对其E基因的遗传稳定性进行了研究。结果表明,经连续传代60次后病毒E基因趋于稳定,BSF.ZZ-1毒株E蛋白氨基酸位点E21(A→V)、E200(T→A)、E244(G→E)、E279(M→K)和E426(G→D),以及BSF.ZZ-3毒株的E244(G→E)、E255(F→L)、E285(M→L)、E368(L→S)和E497(N→S)传代后发生稳定点突变。与JEV毒力相关的部分位点如E107、E138、E176、E177和E315遗传稳定性较高,经连续传代后均未发生突变,与疫苗株SA14-14-2相应位点完全一致。但是,另外一些位点的遗传稳定性较差,如BSF.ZZ-3的E279(M→K→M)出现反复突变。这些突变是否与JEV的宿主细胞适应性及毒力变化相关有待进一步研究。

猪带绦虫AgB与猪CD58或IFN-γ共表达质粒的构建及其在BHK-21细胞中的表达

猪囊尾蚴病是一种重要的人畜共患病,研制有效、安全、廉价的疫苗是当前主要的研究方向之一。本试验通过PCR方法,从含猪囊尾蚴B抗原(AgB)、猪CD58和猪IFN-γ的重组克隆质粒中扩增出AgB、CD58和IFN-γ基因,然后将其克隆到真核表达载体pBudCE4.1中。重组表达质粒鉴定后,在脂质体作用下转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)或直接免疫荧光试验分别检测AgB、CD58和IFN-γ在BHK-21中的表达。结果显示,AgB、CD58和IFN-γ在BHK-21细胞中都成功表达,这为研制抗猪囊尾蚴DNA疫苗奠定了坚实基础。

水泡性口炎病毒感染BHK-21细胞的超微结构改变

应用超薄切片技术对水泡性口炎病毒(VSV)在BHK-21细胞上的形态发生和早期发育进行了观察。结果表明,VSV能导致BHK-21细胞圆缩,胞浆严重空泡化,线粒体嵴断裂及空泡化;病毒在细胞浆内复制、增殖,在细胞膜上以出芽方式获得囊膜而成熟。

猪α干扰素在BHK-21细胞中的表达与生物活性分析

为了构建猪α-干扰素(PoIFN-α)的真核表达系统,鉴定其生物学活性,分离猪的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增猪α-干扰素基因序列,克隆至pcDNA3.1(+)载体,并转染BHK-21细胞。通过G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用real-time PCR及ELISA测定PoIFN-α基因在BHK-21细胞内的表达,利用淋巴细胞增值试验(MTT)检测表达蛋白的生物学活性。结果表明:稳定整合PoIFN-α基因的BHK-21细胞系其PoIFN-αmRNA的转录效率比阴性对照组提高1.52倍,蛋白表达量显著提高1.35倍。MTT试验表明真核表达PoIFN-α淋巴细胞增值活性与阴性对照组相比差异显著(P<0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIFN-α具有良好的生物学活性,为开发新型抗病毒制剂奠定基础。

用原位RT-PCR对BHK-21细胞中的FMDV检测和定位

目的为了明确FMDV在BHK-21细胞中的复制和增殖部位,建立原位检测FMDV的方法。方法以地高辛标记的寡核苷酸作为探针,用间接原位RT-PCR技术对实验接种FMDV的BHK-21细胞中的FMDV RNA进行检测和定位。结果在接毒细胞的细胞质中有大量强阳性蓝染颗粒,阴性对照细胞中没有蓝染颗粒出现,也没有明显的背景染色。结论结果表明FMDV RNA在细胞的细胞质中进行复制和增殖,同时也表明原位RT-PCR是检测细胞内病毒的一种敏感、特异的方法。

横纹肌样瘤的起源研究——高变异率BHK-21细胞致裸鼠产生恶性横纹肌样瘤的实验研究

横纹肌样瘤（ＲＴ）的起源迄今仍是世界上悬而未决的重大难题。第一例ＲＴ发现于肾脏。但迄今发现的ＲＴ均难以复制成功。在纯化３代的肿瘤阴性对照猫肾和犬肾原代细胞皮下接种裸鼠的致癌／致瘤率为０％（０／３２），肿瘤阳性对照Ｈｅｌａ细胞皮下接种裸鼠产生进行性生长恶性肿瘤的比率为１００％（４０／４０）的前提下，ＢＨＫ－２１细胞皮下接种裸鼠均产生进行性生长的恶性肿瘤（６５／６５），其中染色体众数为４０±２（比率５８％～６８％）的ＫＡ株致ＲＴ比率为５２．３８％（１１／２１），具有两个染色体众数４０±２（比率４１％～５３．５）和７２±２（比率３１％～３５％）的ＹＡ株致ＲＴ的比率为８３．３３％（１０／１２），染色体众数为７３±３（比率４２％～５０％）的成瘤细胞体外再培养ＮＭ２８／ＹＡ株致ＲＴ的比率为７１．４３％（１５／２１），染色体众数为４２（比率２８％～３０％）的Ｍ株致ＲＴ的比率为０％（０／１０），致形态类似于分化比较好的平滑肌肉瘤的恶性肿瘤的比率为１００％（１０／１０），可见ＢＨＫ－２１细胞不能用作病毒活疫苗培养基质，可替代Ｈｅｌａ细胞用作恶性肿瘤阳性对照细胞。高变异率ＢＨＫ－２１细胞株皮下接种无胸腺裸鼠大多产生恶性ＲＴ（２?