DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立

目的构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。方法以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过NotI和BamHI双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,以NotI和BamHI双酶切以及测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒以Lipo-fectamineTM2000转染到BHK21细胞,通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选,建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western blotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达。结果双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入真核表达载体pIRES-neo中,测序结果表明DC-SIGN基因与原序列一致。pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后,获得了稳定表达DC-SIGN分子的细胞系。流式细胞仪检测结果显示,阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%。免疫荧光结果显示,DC-SIGN分子主要表达于细胞膜表面。Western blotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带。结论成功构建了稳定、高效表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。

H1N1甲型流感病毒在BHK21中的增殖规律

BHK21细胞是多种动物病毒的易感宿主,是病毒疫苗生产的常用基质,为了解H1N1甲型流感病毒在BHK21细胞中的增殖规律,本研究建立了定量检测甲型H1N1流感病毒M基因表达水平的SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,用于研究H1N1甲型流感病毒在BHK21细胞中的增殖规律.结果发现:用1MOI H1N1甲型流感病毒接种BHK21,细胞于感染后24 h开始出现细胞病变,36h细胞大量脱落和崩解;病毒定量检测结果显示,H1N1甲型流感病毒增殖迅速,于感染后6、12、24、36 h病毒滴度分别为1.77×106拷贝/mL、2.39×106拷贝/mL、6.58×105拷贝/mL、2.87×105拷贝/mL.研究结果证实本实验建立的RRT-PCR能用于H1N1甲型流感病毒的精确定量,病毒在BHK21细胞中的增殖规律为利用细胞毒生产疫苗提供了参考.

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２－ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游，构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ，分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明，ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达，７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。

BHK21细胞悬浮培养的驯化和质量评价

目的:将贴壁培养型BHK21细胞驯化成适合口蹄疫疫苗生产的无血清全悬浮培养型细胞.方法:引进贴壁培养型BHK21细胞,通过改变培养液和降低血清的方法进行悬浮培养的驯化,对驯化得到的悬浮培养型细胞进行生物学检定.结果:引进的BHK21细胞低血清驯化培养22代可悬浮生长,用无血清培养基培养10代后形态趋于稳定生长变快.贴壁和悬浮细胞均有致瘤性,对口蹄疫病毒敏感,适应生物反应器高密度培养,且没有外源物污染.结论:驯化的BHK21细胞可用于口蹄疫疫苗的研究和生产.

乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2在BHK21细胞上传代后的基因序列研究

目的:研究乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2在BHK21细胞上传代后的病毒基因序列,以深入控制乙型脑炎减毒活疫苗的安全性。方法:将乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2在BHK21细胞上连续传代,选取第二代病毒(P2)、第五代病毒(P5)、第十五代病毒(P15)提取RNA,反转录为c DNA后,进行各代病毒全基因序列分析,分析与乙型脑炎病毒毒力密切相关的关键位点基因是否发生改变。结论:乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2在BHK21细胞上传5代后,病毒E蛋白上关键基因第279位(E279)氨基酸由甲硫氨酸(M)突变为赖氨酸(K)。

BHK21细胞的悬浮驯化及其悬浮培养参数研究

[目的]探讨各种悬浮培养条件对BHK-21细胞悬浮培养的影响,尤其是细胞生长过程中出现的细胞结团现象对细胞生长状态的影响,从而摸索出稳定的培养条件。[方法]将BHK-21细胞株进行悬浮驯化培养,通过对悬浮培养的培养液、pH、溶解氧、罐压、搅拌等各种细胞相关生长条件进行研究。[结果]细胞的结团严重影响了细胞的生长代谢。最佳培养条件为最佳接种浓度0.2×106个/ml,牛血清的最佳含量为5%,BHK21细胞培养液理想pH为7.0~7.2,采用2孔通气的100 r/min有利于BHK21细胞的生长。[结论]为体外规模化细胞培养平台奠定理论基础。

羊口疮病毒F1L蛋白对山羊痘病毒黏附BHK21细胞的影响

以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板,用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列,并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析;优化合成059基因编码序列,连接载体pET42a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3);用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌,采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白,并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度;将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层,分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育,利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0 h的细胞黏附GTPV的量,研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明:成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列,其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域,显示出肝素结合活性;该蛋白羧基端有2个跨膜区,不利于蛋白质的表达,但优化DNA序列构建的重组质粒菌,经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达;免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性;Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06 mg/mL;荧光定量PCR检测数据显示,不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同,表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用,能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。

组织型纤溶酶原激活剂cDNA在BHK21细胞中的表达

将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游，构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞，ＥＬＩＳＡ检测结果表明，ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ在哺乳动物细胞中能够表达，７２ｈ表达量分别是５２．８μｇ／Ｌ和７０．４μｇ／Ｌ。

幼小仓鼠肾细胞(BHK21)低血清驯化及代谢比较

以幼小仓鼠肾细胞(BHK21)为研究对象,将DMEM培养基中血清体积分数从15%降至1%进行驯化培养。比较驯化过程中细胞的生长变化;同时测定血清体积分数由15%降至2%的过程中,培养液中葡萄糖、谷氨酰胺等氨基酸以及乳酸、氨的浓度变化。结果表明,血清体积分数由15%降至2%,细胞生长的延迟期延长96 h;同时细胞对葡萄糖、谷氨酰胺的代谢速率以及乳酸的积累速率都降低了50%,而氨的积累速率降低了29%。

无血清培养基悬浮培养BHK21细胞驯化的研究

本研究主要探索用常规BHK21贴壁细胞(F38)驯化为适应无血清培养基的全悬浮细胞的过程并使用生物反应器放大进行了相关研究。实验表明:常规BHK21细胞通过运用相应的商品化培养基进行低血清贴壁驯化、再到低血清全悬浮驯化、最后到无血清全悬浮驯化,使细胞达到全悬浮的状态。经过四十代的传代后,细胞在无血清悬浮培养基中生长细胞数量可达3.0×106/mL以上,且形态较好,倍增时间稳定,活力在90%以上。实验中采用速降和缓降两种方法进行过渡驯化,结果表明,在贴壁状态下,细胞对缓降方式比速降方式适应性要好,细胞的形态较好,活力在90%以上。细胞从低血清悬浮到无血清悬浮过程中,两种过渡方式无明显差异,均经过了5～10代驯化,细胞就完全适应了无血清悬浮培养基。无血清悬浮细胞从液氮中复苏后,采用直线放大的形式从1.5 mL到250 mL再到5 L反应器最后到650 L反应器中生长。在培养参数方面进行了摸索,最终验证用直线放大的方法是可行的。细胞数量可达4.5×106/mL左右,细胞活力在90%以上,且细胞在放大过程中,形态良好,倍增时间稳定在18 h。

60Coγ-射线辐照新生牛血清对BHK21培养细胞的影响

目的:研究新生牛血清(newborn calf serum NBCS)γ-射线辐照后对BHK21细胞培养的影响。方法:用20kGyγ-射线辐照NBCS后培养BHK21细胞,通过连续传代培养和低密度生长曲线比较辐照前后的细胞生长效果。结果:NBCS辐照后连续传代培养10代,每代细胞生长良好,48 h内形成致密单层,与辐照前没有明显区别。NBCS辐照前后低密度培养BHK21细胞第5代平均最大增殖密度为51.35×104/ml、51.20×104/ml、倍增时间21.89 h、22.59 h;第10代为52.25×104/ml、52.73×104/ml和21.95 h、21.62 h,生长曲线基本一致。结论:NBCS 20kGyγ-射线辐照后不影响BHK21细胞的培养效果。

抑制BHK21细胞STYK1/NOK基因的转录组分析

目的转录组分析抑制丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸激酶1(STYK1/NOK)后仓鼠肾正常细胞BHK21的基因表达,并分析其可能作用的信号通路.方法BHK21细胞分为空载体组(转染6μg空载体pBs/U6)、低转染浓度组(2μg si-STYK1/NOK质粒+4μg空载体pBs/U6)和高转染浓度组(6μg si-STYK1/NOK质粒).转染48 h后,Western blot检测STYK1/NOK蛋白表达,基于检测结果,选取空载体组和高转染浓度组提取总RNA进行转录组测序.将测序所得的序列进行过滤比对,获得差异表达基因后,应用R软件进行生物功能(GO)分析和KEGG信号通路分析.应用STRING蛋白质互作数据库中的互作关系进行差异基因蛋白互作网络的分析.采用qRT-PCR验证关键差异表达基因亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(Mthfd2)、转录激活因子5(Atf5),ⅡA分泌型磷脂酶A2(Pla2g2a)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶3(Pfkfb3)的表达.CCK-8法检测空载体组和高转染浓度组细胞增殖情况.结果Western blot结果表明高转染浓度组明显抑制STYK1/NOK蛋白表达.高转染浓度组与空载体组相比,共发现差异表达基因44个,包括19个上调基因和25个下调基因.GO富集分析发现差异表达基因主要影响生物调控、细胞进程、代谢调控、细胞生物过程、细胞、细胞部分、胞外区、配体和催化活性.KEGG通路分析发现差异表达基因主要集中作用于免疫系统、癌症、细胞周期、信号转导和氨基酸代谢等方面.qRT-PCR结果表明,高转染浓度组Mthfd2、Atf5的相对表达量显著上调(P<0.05),Pfkfb3、Pla2g2a的相对表达量显著下调(P<0.05),与测序结果相一致.细胞增殖实验表明高转染浓度组细胞增殖明显高于空载体组(P<0.01).结论抑制BHK21细胞STYK1/NOK表达后,致使BHK21细胞原癌基因表达增强,抑癌基因表达减少,促进细胞增殖.

不同牛血清促悬浮培养BHK21细胞生长的作用

[目的]验证成年牛血清在细胞培养过程中对细胞的促生长作用。[方法]分别以商品胎牛血清、新生牛血清、处理的成年牛血清进行悬浮培养BHK21细胞,通过细胞密度、细胞活力等指标来检测各血清对细胞的促生长作用。[结果]3种血清对细胞的促生长作用差异不明显,都具有良好的促细胞生长作用。[结论]处理的成年牛血清具有良好的促细胞生长作用,与胎牛血清、新生牛血清促细胞生长作用差异不明显。

稳定表达SLAM受体的Vero和BHK21细胞系的建立及其对犬瘟热病毒分离效果的比较

旨在构建稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,并比较其对犬瘟热病毒(CDV)野毒株的敏感性,为CDV野毒株的快速分离与研究提供一种有效的工具。将真核表达载体Pcag-SLAM分别转染Vero细胞和BHK21细胞。经G418压力筛选结合有限稀释法筛选阳性克隆株,并通过RT-PCR、间接免疫荧光鉴定(IFA)和Western blot等方法对稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系加以验证。应用这两种细胞系对3例临床犬瘟热病例的5种不同组织进行病毒分离,对分离得到的CDV进行RT-PCR及IFA鉴定。结果显示,经RT-PCR和Western blot验证,本研究成功构建出SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,SLAM-Vero细胞接种病毒12~24h即可出现典型的CDV导致的细胞融合体CPE,利用SLAM-Vero细胞从3只CDV阳性犬的肺和脾中分离得到2株CDV,而SLAM-BHK21细胞、亲本Vero细胞及亲本BHK21细胞未能分离出病毒。研究表明,与SLAM-BHK21细胞相比,SLAM-Vero细胞对CDV的分离率较高,并能产生明显的CPE。在分离CDV野毒株时,选择肺和脾更容易在SLAM-Vero细胞系上分离出病毒。

BHK21细胞冻存密度与复苏后活力的关系分析

对BHK21细胞不同的冻存密度与细胞复苏后活力的关系进行了统计分析。首先取处于对数生长期的细胞,以4种不同的密度进行冻存,这4种密度分布在0.5×107～4.0×107个/mL之间。冻存2周后,每种密度各复苏3支,计算其活力,分析密度与活力之间是否存在相关性。如此,平行做2次。结果发现,不同的细胞冻存密度与细胞复苏后的活力之间有相关性。

BHK21细胞在新型微载体培养系统生长条件优化

目的:使用BelloCell-500AP生物反应器和BioNOC-II微载体,对BHK21细胞在此新型高密度培养生物反应器中的生长特性进行研究。方法:首先将1.5×108个BHK21细胞悬液加入含有微载体的生物反应器内,按生物反应器厂家推荐参数进行培养,每天取载体计数观察BHK21的生长特性。然后调整细胞浓度和微载体培养系统运行参数。结果:BHK21细胞经过6 d培养载体中细胞总数达到峰值,细胞密度是起始接入数量的31倍为4.41×109个;经过培养过程参数优化,确定适于BHK21细胞高密度培养参数。试验成功实现了BHK21细胞的高密度培养,为以BHK21细胞为生产基质的病毒疫苗生产提供了一条简便快捷的途径。

介绍一种用于BHK21细胞的改良培养基

我们在培养 BHK21细胞的过程中,采用一种改良培养基(以下简称 HLE 培养基),经在87批1902瓶细胞(15立升园瓶)中的使用情况表明,用该培养基培养的 BHK21细胞,细胞成功率高,生长情况良好,能满足疫苗对细胞质量的要求,接毒后的病变。

冷藏保存BHK21细胞悬液及复苏试验

采用方瓶存放BHK21细胞悬液，在2℃～8℃冰箱存放不同时间后，按常规方法进行细胞复苏和传代。对比存放不同时间后细胞复苏时的驯化次数、细胞数量和细胞活力，寻求最佳存放时间和复苏代次以指导生产。同时将2℃～8℃冷藏保存方法与液氮冻存细胞方法在细胞复苏周期和达到所需扩繁细胞数方面进行比较。结果表明，方瓶冷藏保存BHK21细胞悬液最长可存放60d，经2—5代驯化后，细胞形态和活力恢复正常，细胞数量与收悬液前细胞数量无显著差异，并能稳定传20代以上。与液氮冻存细胞方法相比，该方法在快速恢复细胞产量时有较大优势，在生产周期紧张的情况下可作为辅助方法保障细胞传代的延续。

低血清培养的BHK21细胞染色体遗传稳定性分析

[目的]对一种商业化的低血清培养基适应BHK21细胞进行传代培养，并分析该细胞染色体的变异稳定性，以判定其质量。[方法]采用直接法制备4个代次BHK21细胞的染色体标本，用常规Giemsa染色，在1000倍光学显微镜下计数中期分裂相染色体数目，并进行核型分析。[结果]BHK21为亚二倍体或亚四倍体细胞系，亚二倍体总数为42，亚四倍体细胞总数为72～74，该细胞系染色体的畸变率在各代次所占比例为0～2％，均较低。[结论]该细胞系的遗传学特性相对稳定，各代次间无本质差异，可候选为制苗用细胞。

冷冻密度和复苏温度对BHK21细胞活力的影响

就细胞的冷冻密度和复苏温度对细胞活力的影响做了分析。取处于对数生长期的细胞以0．5×107～4．0×107／mL之间的4个细胞密度分别进行冷冻，2周之后复苏细胞，检验其复苏活力；又分别在37℃、38℃和39℃的水温复苏同一批细胞，复苏后检验细胞的活力。结果表明，随着冷冻密度的升高，复苏活力逐渐下降；在38℃水温复苏细胞的平均活力比在37℃和39℃水温复苏细胞的平均活力高，而且稳定。因此，细胞的冷冻密度和复苏活力之间存在显著负相关性，38℃的水温更适于复苏细胞。