应用BIAcore技术对KA-01及主要组分体外抗病毒研究

为了从中草药中找到抗HBV的有效药物,利用BIA技术分析比较中药复方KA-01及其组成部分A、B、C、D对HBsAg和HBeAg蛋白结合的作用,应用HepG2.2.15细胞模型,激光扫描共聚焦显微技术研究了KA-01及其主要组分体外抑制HBV蛋白分泌的活性.结果显示,KA-01、A、B、C和D与HBsAg蛋白结合的响应值分别为200、183.7、162.1、39.1、66.6 RU,与HBeAg蛋白结合很少.KA-01对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分别为62.01%和30.59%,A对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分别为54.26%和14.15%,B对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分别为50.97%和27.92%,C对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分别为17.54%和8.06%.KA-01,A,B体外具有抗HBV活性.

基于生物传感器BiacoreS51技术的新药发现与开发

BiacoreS5 1是目前世界上最先进的基于SPR技术的生物传感器 ,它专门针对药物的研发。该文介绍其在新药发现和开发方面的突出优势 ,以及在分子水平上研究药物候选物ADME方面的性质。

利用基于单链抗体的BIAcore技术检测蔬菜中的杀螟硫磷残留

为建立一种基于单链抗体的蔬菜中杀螟硫磷残留快速检测方法,测定了前期通过核糖体展示所获得的抗杀螟硫磷单链抗体的亲和力和特异性,并建立了基于该抗体和BIAcore X系统检测蔬菜样品中杀螟硫磷的方法。结果表明,获得3株高亲和力单链抗体,其与杀螟硫磷的解离平衡常数分别为4.56×10^(-10)、1.42×10^(-9)、2.66×10^(-10)mol/L,与除对硫磷外的其他有机磷农药的交叉反应率<0.1%(与对硫磷的交叉反应率≤2.8%),说明获得的单链抗体对杀螟硫磷具有很高的特异性。样本添加回收率试验结果显示,该方法的平均回收率介于95.8%~102.2%,相对标准偏差(RSD)≤2.13%,说明该试验方法可靠,可用于实际蔬菜样品中杀螟硫磷的快速检测。

用BIAcore系统研究西妥昔单克隆抗体与表皮生长因子受体的结合

目的:应用基于表面等离子体共振技术的BIAcore 3000系统研究国产西妥昔单克隆抗体(cetuximab)C225与可溶性重组人表皮生长因子受体(EGFR)的结合能力,并与国外已上市的西妥昔单抗Erbitux相比较。方法:在CM5传感器芯片上设置2个通道,一个氨基偶联重组人EGFR作为检测通道,另一个不固定EGFR作为空白参比通道;以HBS溶液作为工作液,流速为10μL/min;活化与封闭芯片;再以10μL/min的流速分别以梯度浓度进样C225和Erbitux,每个浓度级别检测2次;获得结合动态图谱,拟合处理后用软件模块进行参数计算。结果:C225与可溶性重组人EGFR的结合动力学常数KA为4.00×108L/mol,KD为2.50×10-9mol/L;而Erbitux与可溶性重组人EGFR的结合动力学常数KA为4.25×108L/mol,KD为2.35×10-9mol/L。结论:在与可溶性重组人EGFR的结合能力上,C225与Erbitux有相似的结合动力学特性。

特异识别HIV-1序列的锌指蛋白的表达纯化及其在Biacore CM-5芯片上的固定

目的:为了更好地利用Biacore 3000研究锌指与核酸的相互作用,将特异性识别HIV-15′端一段保守序列的三锌指蛋白固定在CM-5芯片上。方法:将特异性识别HIV-15′端一段保守序列5′-CTGTGTTTG-3′的三锌指基因克隆到表达载体pET-22b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组三锌指蛋白,超声碎菌进行SDS-PAGE分析;包涵体形式的表达产物用盐酸胍溶解后,经一步凝胶柱复性并纯化;随后摸索适宜固定的pH值并通过化学方法进行固定。结果:表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化及柱复性后的蛋白纯度为98.8%,并在CM-5芯片上成功固定。结论:本研究为利用Biacore实时定量研究锌指蛋白与其识别DNA的相互作用进行了尝试。

表面等离子体共振（SPR）生物传感器技术的进展—BIACORE J的应用

SPR生物传感器技术正在持续发展着.瑞典BIACORE公司新近推出了用于生物分子间相互作用日常分析的新型号仪器,BIACORE J.应用抗体/蛋白质A及配位基/受体等体系进行了BIACORE J用于活性浓度和键合亲和力测定的考核.结果表明了仪器的高灵敏度和键合响应的重现性.该型号仪器易于操作,并可用于多种领域,SPR技术也因而成为被广泛采用的研究工具.

基于Biacore T200分析系统研究阿达木单抗生物学活性

目的利用Biacore T200生物分子相互作用分析系统研究阿达木单抗的生物学活性。方法将人源阿达木单抗偶联于CM5传感芯片,利用Biacore T200系统观察重组人肿瘤坏死因子α(TNF-α)和食蟹猴TNF-α与阿达木单抗结合的动力学常数,并采用不同种属的重组TNF-α验证种属特异性,进一步研究阿达木单抗抑制重组TNF-α的细胞毒作用,以确认阿达木单抗的生物活性。结果阿达木单抗与重组人TNF-α的结合常数(K_a)为(2.114±0.007)×105,解离常数(K_d)为(5.315±0.220)×10^(-5),亲和力常数(K_D)为(2.515±0.107)×10^(-10);与重组食蟹猴TNF-α的K_a为(2.574±0.068)×105,K_d为(1.554±0.124)×10^(-5),K_D为(5.320±1.271)×10^(-10)。阿达木单抗与50 nmol/L重组人TNF-α、重组食蟹猴TNF-α、重组小鼠TNF-α和重组大鼠TNF-α结合的响应值分别为84.3、66.4、1.3和-0.8 RU,呈现明显的种属差异。阿达木单抗可抑制重组人TNF-α和重组食蟹猴TNF-α对L929细胞的毒性作用,其半数有效浓度分别为194.0和685.5 pmol/L,但对重组小鼠或重组大鼠TNF-α导致的细胞毒作用无影响,细胞水平检测结果与Biacore T200系统检测结果一致。结论用Biacore T200生物分子相互作用分析系统研究抗原抗体结合简便快速准确,该方法适合用于重组人TNF-α单抗生物学活性分析与药效学评价。

Biacore法测定重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗原液的动力学常数

目的：建立Biacore法测定重组人乳头瘤病毒双价（16/18型）疫苗原液的动力学常数。方法：分别将HPV 16·V5中和单抗与HPV 18·J4中和单抗偶联到CM5芯片上，然后根据Biacore X-100 Kinetics/Affinity控制软件将 HPV 16L1和HPV 18L1原液分别稀释至适当的不同浓度，采用50 mmol·L^-1 氢氧化钠溶液作为再生液进行动力学分析。根据Biacore X-100 Evaluation分析软件进行拟合，得到样品的动力学常数KD值。结果：Biacore法测定重组人乳头瘤病毒16型、18型原液动力学常数KD分别为4.844×10^-10 mol·L^-1和1.67×10^-10 mol·L^-1，HPV 16L1和HPV 18L1原液在浓度为0.625-40 μg·mL^-1时线性关系良好（HPV16L1：Y=17.77X-0.0184，r=1.000；HPV 18L1：Y=18.73X＋5.282，r=0.9957）。HPV 16L1和HPV 18L1原液精密度和稳定性试验的RSD均〈20%。并且Biacore法测定的结合常数ka值和体外相对效力测定（IVRP法）的EC50值之间具有一定的相关性。结论：该方法实时、简便、快速、准确、灵敏，适用于重组人乳头瘤病毒原液的动力学分析。

基于表面等离子共振的新型生物传感技术及其在生命科学中的应用

生物分子的活性功能是通过分子之间的相互作用来体现的,了解这种相互作用的过程对于生命科学领域的研究及揭示生命发生发展的基本机制具有重要的意义。基于表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)的新型生物传感技术——BIAcore(biomolecular interaction analysis)是研究生物分子相互作用的理想工具。它可以实时跟踪检测生物分子间结合、解离的整个过程,已被广泛应用于蛋白质组学、信号转导、新药开发、遗传学分析和食品检测等领域,并且显示出广阔的应用前景。

柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体基因的构建及表达产物的生物学活性分析

【目的】构建鼠源抗柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体(dsFv)片段基因,原核表达并将其复性为具有免疫活性的dsFv抗体。【方法】采用PCR定点突变的方法构建dsFv重链(VH)及轻链可变区(VL)基因,分别将其连接入表达载体中,于E.coliBL21(DE3)中诱导表达,表达产物溶解后稀释入复性缓冲液中使其重折叠为dsFv抗体并纯化。SDS-PAGE及Western-blot分析表达及复性产物,BIAcore检测dsFv与Xac-LPS的亲和力,ELISA验证dsFv的特异性及稳定性。【结果】测序结果表明在VH的44位和VL的100位成功引入了半胱氨酸突变位点,实现了高效的原核表达,表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS-PAGE分析显示VH和VL的大小为23kD,并将其成功复性,复性后大小为46kD。BIAcore分析表明dsFv对Xac-LPS保持了很高的亲和力,亲和常数(KD)达到3.40×10-10M。ELISA证明dsFv具有较高的抗原特异性并且热稳定性较scFv提高近20℃。【结论】成功表达并复性了dsFv抗体,为柑橘溃疡病菌的免疫诊断提供了高效优质的重组抗体。

运用表面等离子共振(SPR)生物传感器检测转基因玉米的研究

采用自组装单分子生物膜技术(Self-assembled Monolayer,SAM),将带巯基头的35S启动子寡聚核苷酸探针修饰到镀金的Biacore芯片表面,建立了一种简单、快速、灵敏的表面等离子共振(surface Plasmon Resonance,SPR)DNA生物传感检测系统。研究结果表明,优化的表面等离子共振DNA传感器能够成功地用于转基因玉米PCR扩增样品的检测。

PEG修饰对PLL-EGF基因载体靶向结合作用的影响

聚阳离子基因载体系统由于安全性好和便于设计等优点,近年来在基因治疗中的应用发展迅速.在进行基因药物的体内靶向输送时,目前国际上主要通过在基因输送系统中修饰聚乙二醇(PEG)和靶向分子来提高体内输送的稳定性和靶向性.PEG的修饰可能会遮蔽靶向分子的功能呈现,因此建立定量分析方法评价PEG修饰对靶向结合作用的影响非常重要.将连接有表皮生长因子(EGF)的聚赖氨酸(PLL)基因载体作为研究模型,建立BIAcore检测方法,比较PLL-EGF,PEG7000修饰的PLL-EGF,PEG20000修饰的PLL-EGF对表皮生长因子受体(EGFR)的结合和解离速率,评价PEG修饰对PLL-EGF靶向功能呈现的影响.结果表明,PEG7000的修饰降低了EGF和EGFR之间的结合速率,提高了解离速率,整体减弱了靶向分子的靶向结合能力.PEG20000的修饰进一步减弱靶向分子功能的呈现.因此在进行靶向型聚阳离子基因输送系统设计时,考察PEG修饰对靶向结合能力的影响程度非常重要.该研究结果也对其他基因载体系统的设计提供必要的参考.

柑桔溃疡病菌重组单链抗体的高效表达及活性检测

运用PCR方法扩增利用核糖体展示技术筛选的抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,XAC)的单链抗体(ScFv95)基因片段,将单链抗体基因重组到原核表达载体pET30a(+)中,构建单链抗体高效表达载体pET30a(+)-XAC-ScFv。再将pET30a(+)-XAC-ScFv质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,并对表达产物进行纯化、复性及活性检测。获得了抗XAC单链抗体的高效表达蛋白,以包涵体形式存在的表达蛋白大小约32kDa。包涵体蛋白经过变性、纯化和复性后,初步获得有功能的单链抗体。同时用Biacore分析XAC-ScFv-95与XAC LPS作用,结果表明复性后的XAC-ScFv-95具有较高的亲和力,从而为柑桔溃疡病菌XAC的免疫诊断和防治研究提供了新的工具和途径。

基于表面等离子体共振(SPR)技术实时分析RGD基序与整联蛋白的相互作用

旨在研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1上的RGD(Arg-Gly-Asp)基序与宿主细胞表面受体整联蛋白的结合特异性,作者应用基于表面等离子共振技术(SPR)的Biacore 3000系统实时研究RGD基序分别与猪源整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域、α_v亚基胞外区结构域和β_6亚基胞外区结构域的亲和力。首先通过结合试验筛选与RGD基序有结合的整联蛋白结构域,再对有结合的整联蛋白与RGD基序开展动力学分析。结果显示,合成的RGD基序与猪源整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为42.3 M~(-1)s~(-1)、3.1×10~(-4)s~(-1)和7.33×10~(-6)M;与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间亦有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为21.8 M~(-1)s~(-1)、2.13×10~(-4)s~(-1)和9.79×10~(-5)M;与β_6亚基胞外区结构域几乎没有结合。综上表明,RGD与整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域的结合比与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间的结合快且亲和力强。本研究将为进一步探讨FMDV与宿主细胞表面受体的相互作用提供参考。

地龙对肺炎支原体感染小鼠肺组织中表皮生长因子EGF表达的影响

目的探讨地龙对肺炎支原体感染小鼠肺上皮组织的影响。方法利用Biacore技术检测地龙提取液在体外与表皮生长因子(EGF)蛋白的结合能力,再配合体内药效学实验进行验证。将60只雌雄各半的BALB/c小鼠随机分为空白组,模型组,阳性对照组(阿奇霉素22.5 mg·kg^(-1)),地龙高(4.7 g·kg^(-1))、中(2.35 g·kg^(-1))、低剂量组(1.175 g·kg^(-1));经鼻滴入20μL 1×10^(6) CCU肺炎支原体培养液建立肺炎支原体模型。模型小鼠经药物治疗两周后,HE染色法观察给药前后小鼠肺组织病理差异,通过免疫组化(IHC)、Western blot和RT-PCR方法测定各组小鼠肺组织中EGF蛋白和mRNA的表达量。结果Biacore实验结果表明在体外地龙提取液与EGF蛋白能较好地结合;HE染色显示,地龙中、高剂量组均能促进肺组织结构完整,减少炎性细胞;与模型组比较,地龙中、高剂量组小鼠的EGF蛋白和mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。结论地龙可通过影响EGF的表达,改善肺炎支原体感染症状,修复损伤的肺上皮组织。

免疫学技术及其应用

内容简介：本书首先介绍了天然免疫和获得性免疫中免疫细胞（包括单核巨噬细胞、DC、NK、T细胞、B细胞等）、免疫分子（包括抗体、补体、细胞因子、HLA、TLR等）的理论背景和研究方法。然后介绍了免疫学相关实验技术，如免疫标记技术、流武细胞检测和分选技术、免疫相关分子生物学技术、蛋白质电泳技术、凋亡检测技术等的原理和应用，并融合了免疫学最新前沿技术，如RNA干扰技术、miRNA技术、蛋白质相互作用、BIAcore技术、激光扫描共聚焦显微镜技术、动物疾病模型、

茶叶中杀冥硫磷含量的测定

杀螟硫磷是有机农药中的一种,在蔬菜类农作物的加工中常用杀螟硫磷作为主要的农药和杀虫剂。而农药的大量使用也使得蔬菜的叶片中残留有大量的杀螟硫磷,对人体健康造成了严重影响。因此本文以茶叶为例,采用基于单链抗体的BIAcore技术,对茶叶叶片中杀螟硫磷含量进行了检测,检测结果表明该方式的样品平均回收率在94.5%~101.3%,RSD≤2.2%,这说明此方式具有较好的检测能力,可以用于叶片类蔬菜农作物中的杀螟硫磷含量检测。

IL-17A单克隆抗体生物学活性检测方法的建立

目的建立2种检测IL-17A单克隆抗体的生物学方法。方法(1)利用BIAcore T200系统,基于表面等离子共振技术(surface plasmob resonance,SPR)的分析方法检测IL-17A的生物学活性。(2)采用IL-6释放抑制法测定IL17-A单克隆抗体生物学活性。结果采用SPR法获得的偶联最佳pH值为5.0,动力学常数为0.10086 nmol·L^(-1),样品浓度为2.0625~33 nmol·L^(-1);IL-6释放抑制法检测的曲线拟合常数R2均满足>0.95,相对活性均在80%~125%,多次试验的RSD≤20%,满足重复性验证标准,符合要求。结论2种检测方法的结果均较好,可以有效地反映IL-17A的生物学活性,可以简单、快速用于检测IL^(-1)7A单克隆抗体生物活性。

不同粒径的Au纳米粒子对SPR技术定量分析灵敏度的影响

目的通过比较不同粒径金纳米粒子(Au NPs)对表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)系统信号放大的影响,筛选最适粒径的Au NPs,从而建立一种新的SPR方法用于猕猴血清中西妥昔单抗(C225)定量分析。方法利用柠檬酸还原HAuCl4法自行制备3种粒径Au NPs并分别与羊抗人IgG进行偶联,将偶联物引入BI-Acore系统进行SPR信号采集,筛选最适粒径的Au NPs,进而利用BIAcore系统建立猕猴体内C225定量分析标准曲线。结果自行制备的Au NPs形状相对圆润,大小均一。几种粒径的Au NPs均能引起SPR信号放大,但粒径不同则SPR信号放大情况不同,其中10 nm Au NPs的SPR信号放大作用最为明显。结论将特定大小的Au NPs引入SPR定量分析系统能够显著提高SPR信号强度,从而进一步提高SPR定量分析灵敏度。