猪圆环病毒2型感染性克隆构建

基于PCV2滚环复制原理,在分析PCV2不同基因亚型代表毒株基因组结构和序列的基础上,设计2对引物用于PCR扩增PCV2基因组序列。以从收集到的疑似PCV2感染的10份猪血清样品中提取的DNA为模板,用设计的引物扩增目的片段,并进行测序分析,1株为PCV2a型,4株为PCV2b型,5株为PCV2d型。每种基因型毒株中各选取一个样本,利用上述2对引物进行PCR扩增,并将扩增产物克隆至pEASY-Blunt simple载体中,通过双酶切连接2个PCR片段,构建含有约1500 bp重叠序列的PCV2基因组的质粒。通过脂质体转染法将含PCV2全基因组的质粒转染至PK-15细胞进行病毒拯救,经PCR和IFA两种方法验证,证明成功拯救出3个基因型的PCV2毒株。通过对PCV2全基因组结构及序列分析,该方法同样适用于PCV2g、PCV2h基因型病毒的感染性克隆构建。本研究建立了一种基于反向遗传学技术的PCV2感染性克隆的构建方法,为开展PCV2的病原学研究提供了技术支持。

笃斯越橘E3连接酶基因VuARI2的克隆及其抗寒功能分析

【目的】通过克隆笃斯越橘E3泛素连接酶基因VuARI2及分析其在拟南芥中异源表达,探索笃斯越橘VuARI2基因在低温胁迫响应中的功能。【方法】以笃斯越橘为材料,用RT-PCR和RACE技术从茎中克隆获得VuARI2基因,并对其进行系统生物信息学分析;用qRT-PCR技术分析该基因在不同组织中及低温胁迫处理下的表达模式;在拟南芥中异源表达VuARI2并对其进行冷驯化后表达水平、生理指标及冰冻处理后的抗寒性分析。【结果】VuARI2基因编码区长1770 bp,编码589个氨基酸。泛素连接酶VuARI2与野山茶、咖啡树、葡萄和河岸葡萄ARI2蛋白的氨基酸序列同源关系较近。qRT-PCR结果显示,VuARI2基因表达具有组织特异性,在叶和花芽中VuARI2的表达量显著高于根和茎中;茎和花芽VuARI2表达受低温诱导较显著。转基因植物的VuARI2基因表达量在冷驯化后显著高于野生型;总叶绿素含量降幅显著低于野生型;脯氨酸和可溶性糖含量显著高于野生型;超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性均显著高于野生型,而相对电导率和丙二醛含量显著低于野生型。冷驯化后转基因植物在冰冻低温下存活率显著高于野生型,相对电导率显著低于野生型,提高了植物抗寒性。【结论】克隆获得了笃斯越橘VuARI2基因,过表达VuARI2基因可以提高植物抗寒性。

猪圆环病毒2型HZ0201株分子克隆的感染性分析

通过PCR扩增猪圆环病毒2型HZ0201株的全长基因组,克隆到pBluescript SK+载体SacⅡ位点;同时以SacⅡ切出PCV2全长DNA,并进行自身环化,分别构建PCV2全长基因组重组质粒和首尾相接的环化DNA。利用脂质体分别将PCV2重组质粒和环化DNA转染PK-15和Vero细胞,免疫组织化学试验(IHC)结果显示二者均检出PCV2阳性抗原。其中PCV2环化DNA转染细胞的阳性率显著高于PCV2重组质粒。将转染细胞进行连续8次传代,以IHC对每代病毒检测表明,PCV2分子克隆在PK-15细胞中形成的病毒能稳定感染,并且滴度逐步增加;而在Vero细胞上复制能力不强,传到第四代即不能检出病毒。

龙眼胚性愈伤组织fw2.2家族2个基因的克隆与分析

fruit weight 2.2(fw2.2)是植物中控制果实重量的重要数量性状的主效基因。以龙眼转录组数据库为基础,采用同源克隆法及RACE技术,从龙眼的胚性愈伤组织中获得fw2.2家族的2个cDNA全长序列,命名为Dlfw2.2-1与Dlfw2.2-1,并对其核甘酸序列及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明:Dlfw2.2-1基因的cDNA全长为970 bp,编码184个氨基酸;Dlfw2.2-2基因的cDNA全长为941 bp,编码175个氨基酸。Dlfw2.2-1与Dlfw2.2-2的核甘酸序列及其推导的氨基酸序列与其它植物的fw2.2具有较高的同源性,亚细胞定位于细胞质膜,不含信号肽,具有跨膜结构与典型的与PLAC8同源的富半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich Protein)的保守结构域。植物中fw2.2系统进化树分析结果表明,Dlfw2.2-1和Dlfw2.2-2为同一分枝,与番茄和油梨的fw2.2的距离最近。因此,推测Dlfw2.2-1与Dlfw2.2-2属于fw2.2基因家族的2个成员。

BIOMED-2基因重排检测在疑难淋巴组织增生性疾病诊断中的应用

目的 探讨在疑难淋巴组织增生疾病中BIOMED-2基因重排检测的诊断价值.方法 对874例疑难淋巴组织增生性疾病进行BIOMED-2克隆性分析和免疫组化染色,并对相关病例进行了EBER原位杂交、HP核酸测定.结果 疑难淋巴组织增生性病变874例,经检测确诊为恶性淋巴瘤565例,其中经典型霍奇金氏恶性淋巴瘤55例,B型细胞非霍奇金恶性淋巴瘤359例,BIOMED克隆性分析阳性率为10.5％～85.7％,T细胞非霍奇金氏恶性淋巴瘤112例,BIOMED克隆性分析阳性率在0％ ～ 88％.结论 BIOMED-2克隆性分析对疑难的T细胞淋巴瘤诊断帮助较大.对于免疫组化bcl-2染色阴性的滤泡性淋巴瘤检测阳性率较高.如果标本前期处理不规范或者恶性细胞比率过低就会造成假阴性结果.

小花碱茅HKT2;1基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

Na+是盐渍化土壤中主要的毒害离子,对植物生长发育和农业生产构成严重威胁。高亲和性K+转运蛋白HKT2;1在控制高等植物Na+吸收,增强K+的选择性,进而提高耐盐性方面发挥着重要作用。本研究以拒盐型牧草小花碱茅为材料,采用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends)方法克隆到HKT2;1基因,并命名为PutHKT2;1。该基因全长1 919bp,包含1个长1 638bp的开放阅读框(ORF),编码546个氨基酸,推测分子量为60.5kDa,等电点PI为9.07。与其他植物HKT2;1氨基酸序列同源性多在66%以上,核苷酸序列同源性都在75%以上。PutHKT2;1可能跨膜11次,二级结构分析表明,PutHKT2;1蛋白含有47.99%α-螺旋、5.13%β-转角、31.87%无规则卷曲和15.01%延伸链。PutHKT2;1基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析为进一步揭示小花碱茅拒盐的分子机制奠定了基础。

猪Fosl2基因克隆、结构预测及其mRNA发育性表达变化

本试验旨在克隆猪Fosl2基因CDS序列并对其进行分析,研究该基因在猪的不同阶段各种组织(心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、背部脂肪)中的发育性表达规律。以豫南黑猪为材料,利用RT-PCR技术克隆猪Fosl2基因CDS区域,利用生物信息学方法预测蛋白结构,应用qRT-PCR检测豫南黑猪7~180日龄上述组织中Fosl2基因的发育性表达。结果表明,猪Fosl2基因的CDS区为984bp,编码327个氨基酸,跨膜序列为17~33位氨基酸,该肽链没有信号肽,为跨膜非分泌型蛋白,在122~187位氨基酸的位置存在亮氨酸拉链结构域,核苷酸和氨基酸序列同其他种属间的保守性很高。Fosl2基因拥有广泛的组织表达谱,在心、肝、脾、肾、肺、背最长肌和背部脂肪的不同发育阶段均有不同程度的表达,而其在肺中的表达量均高于同时期其他组织内的表达量,推测猪Fosl2基因可能与肺部组织的发育有关;其在背部脂肪不同发育阶段的变化趋势表明其可能参与调控猪脂肪的生成进而影响瘦肉率。本研究结果将为进一步研究猪Fosl2结构及其多功能奠定基础。

鸭Mef2bnb基因的克隆及其mRNA丰度在肌肉组织中的发育性表达变化

旨在克隆鸭肌肉增强因子2b邻居基因(Myocyte enhancer factor 2Bneighbor,Mef2bnb)的cDNA全序列,并对其进行分析,研究该基因在肌肉组织中的发育性表达规律。利用RACE技术从鸭腿肌中克隆出Mef2bnb的全长cDNA序列,应用Q-PCR技术检测了自鸭胚胎10d至出壳1周肌肉组织中Mef2bnb基因的发育性表达。结果显示:该序列全长935bp,包括5′非编码区(5′UTR)51bp和3′非编码区(3′UTR)518bp,完全开放阅读框(ORF)366bp,可编码121个氨基酸残基,结构分析表明,该肽链没有信号肽,第1～117号氨基酸为鸭Mef2bnb基因与其它动物高度保守的NEP结构域;Mef2bnb基因在胸肌、腿肌和心脏3种肌肉组织中不同阶段均有不同程度的表达,而其在胸肌中的表达量均高于同时期在腿肌中的表达量,推测鸭Mef2bnb基因可能具有促进Ⅱ型纤维形成的功能,另外该基因在心脏的高表达表明其可能与心脏的发育有关。本研究结果将为进一步研究鸭Mef2bnb结构及其在肌肉组织中的作用奠定基础。

斑鳢叉头框转录因子基因Foxl2的克隆表达及性类固醇激素刺激下的表达响应

为探究叉头框转录因子Foxl2基因(forkhead transcription factor gene 2)在斑鳢Channa maculata性腺发育过程中的作用,采用RT-PCR和RACE技术克隆出斑鳢Foxl2基因,利用qRT-PCR解析Foxl2基因在雌雄斑鳢1龄成鱼组织、不同发育时期性腺中的表达情况,以及外源性激素诱导后雌雄斑鳢性腺中Foxl2的表达变化,通过酶联免疫法测定性腺不同发育时期雌雄斑鳢血清中的雌性激素(estrogen,E)总含量,并利用免疫组化技术检测性腺中Foxl2蛋白表达的细胞类型。结果表明:克隆获得斑鳢Foxl2 cDNA序列全长为1939 bp,开放阅读框(ORF)为921 bp,共编码306个氨基酸;组织表达分析显示,Foxl2在卵巢中表达量最高且极显著高于精巢(P<0.01),但在鳃和脑组织中雄鱼表达量显著高于雌鱼(P<0.05);性腺发育时期表达分析显示,Foxl2在卵巢中表达量高于精巢,且在孵化出膜后105 d时,卵巢中表达量达到最高,精巢中表达量最低,两者表达量存在极显著性差异(P<0.01),血清中雌激素总含量变化与之相似;免疫组织化学检测显示,Foxl2蛋白表达于斑鳢卵巢成熟卵母细胞周围的颗粒细胞,精巢中未检测到Foxl2表达信号;经外源性类固醇激素17α-乙炔基雌二醇(17α-ethynylestradio,EE2)和17α-甲睾酮(17α-methyltestosterone,MT)处理后,卵巢中Foxl2的表达均受到抑制,但精巢中表达水平被EE2上调,被MT下调。研究表明,Foxl2基因在斑鳢性腺中呈现明显的性别二态性表达,推测其参与卵巢的发育和维持,通过外源激素诱导,Foxl2可能响应性类固醇激素的调节,本研究从mRNA和蛋白层面初步揭示了Foxl2在斑鳢性腺发育中的重要作用,为深入研究其性别分化机制及性别控制技术提供了科学参考。

甘蓝和油菜中类硫氧还蛋白THL2基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT PCR方法 ,对甘蓝和油菜的基因组DNA和柱头总RNA进行扩增 ,获得了类硫氧还蛋白THL2的DNA和cDNA。序列分析首次表明THL2基因有两个内含子 ,并且在油菜和甘蓝中的大小不同。进一步分析表明 ,油菜和甘蓝中THL2DNA序列的同源性为 96 %

鼻咽癌细胞株体外诱导同种异体T细胞TCR Vβ CDR3谱型和细胞毒性分析

目的用鼻咽癌细胞株CNE2体外负载同种异体树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导T淋巴细胞,使之活化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),观察其体外特异性杀伤和克隆性增殖。方法用GM-CSF,IL-4和TNF-α体外诱导健康志愿者外周血单核细胞,用CNE2负载,使之分化为成熟DC,流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征。在IL-2的作用下,用负载CNE2抗原的DC诱导自身T细胞生成特异性CTL。乳酸脱氢酶释放法检测其特异性杀伤活性;采用免疫谱型分析技术分析T细胞的克隆性。结果健康志愿者外周血单核细胞体外在GM-CSF,IL-4和TNF-α诱导下获得具有典型表型特征的成熟DC,其诱导的CTL对CNE2有明显的特异性杀伤作用;PBMC的TCRVβCDR3谱型呈高斯分布,而诱导后的T细胞部分家族出现优势表达。结论负载鼻咽癌抗原的同种异体DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用,优势表达的TCRVβCDR3家族对鼻咽癌治疗有潜在的临床应用价值。

猪输血性传播病毒2型全基因组的克隆与序列分析

为了监测猪输血性传播病毒2型(TTV2)的疫源和进化情况,为进一步研究TTV2的形态结构、遗传变异和基因功能奠定生物学基础,参照国外发表的猪输血性传播病毒(TTV)全基因组核苷酸序列(GU456386.1),设计3对特异性引物,采用巢式PCR对采自四川省的疑似猪输血性传播病毒感染的血清样品进行TTV全基因组的克隆、测序和拼接,并对其进行同源性分析和遗传进化分析。结果显示,该基因组全长2 802bp,与国内外参考株同源性介于87%～96%之间,ORF1的同源性介于81%～95%;ORF2的同源性较高,介于93%～99%之间。系统进化树分析表明,该分离株与美国株PTTV2c-VA的同源性高达96%。结果表明,该毒株为TTV2,与国内外参考株有一定的相似性。

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的研制和鉴定

应用杂交瘤技术,以低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株作为免疫原,制备出3株稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株C2C5、D3B10和C2H8。对单抗的特异性鉴定结果表明:腹水单抗C2C5、D3B10和C2H8的间接ELISA效价分别为5×214、210、5×212,但均无HI效价。3株单抗的免疫球蛋白亚类均为IgG2a。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示:单抗C2H8和D3B10与AIV H9N2和AIV H5N1均有60 kD的蛋白条带反应,而不与其他条带反应,表明这两株单抗特异性地针对AIV H9和AIV H5的共同抗原成分60 kD NP蛋白。而C2C5不与电泳蛋白条带反应,说明该单抗不是针对线性表位的,而可能是针对空间表位的。

猪圆环病毒2型流行株的分离及其感染性克隆的构建

【目的】通过分离一株猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株,并构建其感染性克隆,为研究PCV2基因功能提供操作平台。【方法】通过PCR方法,从疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪淋巴结中鉴定为猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)2型阳性。把阳性病料接种PK-15细胞传代培养,在培养物中扩增出PCV2的全基因序列。对扩增出的全序列进行序列测定,并与GenBank中公布的5株广东PCV2分离株(GD-pz、GD-gj、GD-jm、GD-ss和GD-sz)进行同源性分析。通过EcoRⅠ和SalⅠ将PCV2全基因组序列克隆进pUC18载体中,获得含PCV2 GD-zq株全基因组单拷贝的重组质粒pPCV2-GD-zq,再通过SalⅠ和HindⅢ把另一个全长拷贝克隆进pPCV2-GD-zq质粒中,使PCV2 GD-zq株基因组DNA以头尾相接的双重复方式克隆进pUC18载体中,获得重组质粒pPCV2-2GD-zq。将pPCV2-2GD-zq DNA纯化和定量后转染PK-15细胞,拯救PCV2 GD-zq病毒。【结果】从PMWS感染的猪淋巴结中分离到了一株PCV2,命名为GD-zq株;序列分析结果显示,GD-zq株全基因组为1 767 bp,与GenBank中公布的5株广东PCV2分离株ORF1核苷酸一致性为97.1%-99.7%,编码氨基酸一致性为98.7%-100%;ORF2核苷酸一致性为93.2%-99.6%,编码氨基酸一致性为92.3%-99.1%;全基因一致性为96.0%-99.6%。pPCV2-2GD-zq质粒转染PK-15细胞后,其通过间接免疫荧光实验(IFA)能从转染细胞及其传代细胞中,检测到拯救出的病毒。【结论】分离了一株PCV2广东株GD-zq,成功构建了PCV2 GD-zq株的感染性克隆。

真性红细胞增多症20例患者JAK2V617F基因突变分析

真性红细胞增多症（PV）是一种较少见的造血干细胞水平异常克隆性疾病，迄今对其确切的发病机制尚不十分清楚，国际真性红细胞增多症研究小组（PVSG）和WHO等对PV的各种诊断标准仍是排他性的，且缺少像慢性粒细胞性白血病（CML）一样的BCR／ABL融合基因特异性标志。最近，有学者报道,

促进原发性血小板增多症血栓形成因素的Meta分析

目的进一步了解未被预测模型IPSET-thrombosis纳入的促进原发性血小板增多症(ET)血栓形成的因素。方法检索PubMed、Web of Science和The Cochrane Library数据库,对292项研究进行系统评价,并计算不同因素ET患者血栓发生率及相对风险比(RR),同时对结果可信度作推荐评分(RS),结合RR值及RS分析找到ET患者血栓形成的风险因素。结果促进ET血栓形成的危险因素有9个。其中包含IPSET-thrombosis纳入的4个因素:血栓形成史(35.0%,RR=3.30,95%CI:2.30~4.75)、JAK2V617F阳性(21.0%,RR=2.28,95%CI:1.14~4.56)、年龄大于60岁(22.4%,RR=1.95,95%CI:1.17~3.23)、心血管危险因素(CVR)(17.7%,RR=1.90,95%CI:1.08~3.35)。以及IPSET-thrombosis未纳入的5个因素:X染色体失活模式(XCIP)的单克隆型(30.6%,RR=4.49,95%CI:1.58~12.77)、JAK2V617F高负荷(33.9%,RR=3.69,95%CI:1.70~7.99)、白细胞增多(18.7%,RR=3.05,95%CI:1.81~5.13)、MPL突变(22.1%,RR=2.40,95%CI:1.08~5.33)、脾肿大(25.6%,RR=1.76,95%CI:1.29~2.40)。结论除IPSET-thrombosis评分系统纳入的4个血栓危险因素外,XCIP单克隆型、JAK2V617F高负荷、白细胞增多、MPL突变、脾肿大5个因素也是促进ET患者血栓形成的因素。

-13／13q-伴17p-多发性骨髓瘤四例临床分析

多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞克隆性增生的恶性肿瘤，呈高度异质性，目前研究提示不良预后因素有年龄、浆细胞形态、乳酸脱氢酶、C反应蛋白、血清β2微球蛋白（β2-MG）、骨髓克隆型浆细胞的增殖指数、分期等，但随着对MM发病机制认识的加深，细胞和分子遗传学异常被认为是MM最重要的独立预后危险因素，并以此为基础进行危险度分层。了解MM患者遗传学的异常与预后的关系，对制定多元化、个体化的治疗策略，

基础理论

白藜芦醇对癌的化学预防作用//黄硐类化合物逆转Heb细胞多药耐药性//氧化砷对MR2细胞耐药蛋白的调节作用//肿瘤患者T细胞克隆性增殖与预后分析//关于PCR扩增体系优化的实验研究//临床级树突状细胞的分离和培养