BJAB细胞在转导6A8 α-甘露糖苷酶的反义DNA后发生oncosis样死亡

目的 采用形态学和分子生物学方法 ,分析转导 6A8α 甘露糖苷酶的反义DNA导致的B细胞株BJAB死亡的性质。方法 用Giemsa染色、annexin Ⅴ荧光染色、梯形DNA电泳以及透射电子显微镜等方法 ,分析细胞死亡的性质 ;应用ConA结合试验 ,检测转基因细胞 6A8α 甘露糖苷酶活性的改变 ;应用Fluo 3探针测定细胞胞浆 [Ca2 +]i。结果 用重组腺相关病毒 (rAAV)颗粒成功地将反义 6A8DNA转导入了EB病毒转化的B细胞株BJAB。在克隆中 ,转导反义 6A8DNA的BJAB细胞在生长到 3～ 1 0个细胞时死亡 ,而野生型、转导空载或转导正义 6A8DNA的BJAB细胞生长良好。转导反义 6A8DNA的BJAB细胞呈聚集状生长 ,且有大量细胞肿胀 ,最终死亡。Giemsa染色光镜观察、an nexin Ⅴ荧光染色、梯形DNA电泳及透射电镜观察结果表明 ,这种死亡是一种oncosis(肿胀死 )样死亡。ConA结合试验表明 ,BJAB细胞在转导反义 6A8DNA后的结合率升高 ,而转导正义 6A8DNA后的结合率则下降。另外 ,转导反义 6A8DNA的细胞胞浆 [Ca2 +]i升高。结论 转导反义 6A8DNA引起BJAB细胞发生oncosis样死亡 ,这种死亡可能与 6A8α 甘露糖苷酶表达被抑制有关。

强化融合蛋白抗CD20（Fab）-力达霉素对淋巴瘤BJAB细胞增殖和DNA损伤的作用

目的研究强化融合蛋白抗CD20（Fab）．力达霉素（LDM）体外对CD20表达阳性的淋巴瘤细胞株BJAB增殖和DNA损伤的作用。方法流式细胞术检测融合蛋白抗CD20（Fab）-力达霉素辅基蛋白（LDP）与BJAB细胞的结合活性；激光共聚焦显微镜观察融合蛋白抗CD20（Fab）-LDP靶向结合BJAB细胞情况；M_rr法检测强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM对BJAB细胞的生长抑制作用；单细胞凝胶电泳（SCGE）检测强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM对DNA的损伤；流式技术检测强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM诱导BJAB细胞的细胞周期的改变。结果融合蛋白抗CD20（Fab）-LDP与BJAB细胞结合活性为阳性；激光共聚焦显微镜下观察，融合蛋白抗CD20（Fab）．LDP靶向结合在BJAB细胞表面；强化融合蛋白抗CD20（Fab）．LDM作用于淋巴瘤BJAB细胞后，可以显著抑制BJAB细胞的生长，引起DNA损伤，诱导S期阻滞。结论强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM可以靶向结合淋巴瘤BJAB细胞，并且具有显著的生长抑制作用，其作用机制是引起DNA的损伤。

黄芪多糖调节程序性死亡分子1/程序性死亡配体1信号通路对非霍奇金淋巴瘤发展和免疫逃逸的影响

【目的】观察黄芪多糖对非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治疗作用及机制。【方法】培养WSU-DLCL2、BJAB、SP53等3种NHL细胞,给予不同浓度(0、5、10、50、100、200、400μmol/L)黄芪多糖处理,应用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力,筛选黄芪多糖最佳浓度、对黄芪多糖敏感的细胞。将WSU-DLCL2细胞分为对照组、黄芪多糖组、BMS-1[程序性死亡分子1(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)通路抑制剂]组、黄芪多糖+BMS-1组,检测各组细胞菌落形成、凋亡、迁移和侵袭情况,Western Blot法检测PD-1/PD-L1信号通路蛋白表达。WSU-DLCL2细胞和CD8+T细胞共培养后,检测CD8+T细胞百分比、凋亡率和上清液中干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。【结果】后续实验选择200μmol/L黄芪多糖处理WSUDLCL2细胞。与对照组比较,黄芪多糖组、BMS-1组和黄芪多糖+BMS-1组WSU-DLCL2细胞菌落形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数,CD8+T细胞凋亡率,及WSU-DLCL2细胞PD-1、PD-L1蛋白表达水平显著下降(P<0.05),WSU-DLCL2细胞凋亡率、CD8+T细胞比例及共培养体系上清液中IFN-γ、TNF-α水平显著升高(P<0.05);与黄芪多糖组、BMS-1组比较,黄芪多糖+BMS-1组WSU-DLCL2细胞菌落形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数,CD8+T细胞凋亡率,及WSU-DLCL2细胞PD-1、PD-L1蛋白表达进一步下降(P<0.05),WSU-DLCL2细胞凋亡率、CD8+T细胞比例及共培养体系上清液中IFN-γ、TNF-α水平进一步升高(P<0.05)。【结论】黄芪多糖可抑制NHL细胞增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡,减少免疫逃逸,其机制可能与抑制PD-1/PD-L1信号通路有关。

CD20特异性启动子调控腺病毒分泌stTRAIL对淋巴瘤细胞的抑制作用

目的:研究腺病毒携带CD20启动子调控的TRAIL基因特异性杀伤B-NHL细胞的作用。方法:人工合成含有CD20启动子片段-分泌信号-异亮氨酸拉链-s TRAIL(aa114~aa281)-真核poly(A)序列的融合基因,装入腺病毒载体Ad Easy系统,包装出携带P20-st TRAIL序列的腺病毒感染细胞,采用荧光素酶报告基因法研究CD20启动子在CD20+细胞系中的特异性转录,Western blotting验证TRAIL蛋白在细胞内的特异性表达,体外MTT法检测TRAIL特异性抑制CD20+细胞生长的作用。结果:成功构建携带P20-st TRAIL序列的腺病毒载体并分别感染CD20阳性和阴性淋巴瘤细胞系后发现,CD20启动子仅在CD20+的BJAB淋巴瘤细胞中具有转录活性、启动s TRAIL表达并在体外形成具有生物学功能的同源三聚体结构;在细胞中和培养上清中均检测到st TRAIL在mRNA和蛋白水平的表达,但在CD20-细胞系中则无明显表达。体外功能实验显示,BJAB细胞在被Ad P20-st TRAIL感染后自身生长受到明显抑制,而Ad P20-st TRAIL感染的CD20阴性细胞以及空白载体感染的细胞未见生长抑制现象。结论:CD20启动子可以特异性调控腺病毒携带的治疗基因st TRAIL的表达,实现TRAIL对CD20+B-NHL细胞的靶向杀伤。