小龙虾prx6基因在对抗金黄色葡萄球菌感染中的分子作用机制研究

【目的】旨在研究prx 6基因在小龙虾先天免疫中的调控作用机制,探索小龙虾prx 6基因在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染后发挥免疫调控作用的可能分子机制。【方法】选取prx 6基因作为研究对象,提取正常小龙虾各组织的总RNA,利用RT-qPCR分析目的基因在小龙虾各组织中的分布,并检测S.aureus免疫刺激后,prx 6基因在小龙虾相关组织中的表达模式。通过RNA干扰技术(RNAi)敲低prx 6基因表达量,在感染S.aureus后,测定小龙虾肝胰腺中Pc-crustin 3、Pc-crustin 4、Pc-ALF 9和Pc-lectin 1免疫效应基因的相对表达量。同时,进一步对小龙虾血淋巴中的细菌载量进行统计分析。【结果】通过对prx 6基因在小龙虾各组织的表达水平分析,观察到该基因在肝胰腺的表达量显著高于其他组织。在S.aureus感染后,小龙虾肝胰腺、血细胞和肠组织中prx 6基因的表达量显著上调,在鳃组织仅有早期表达量有所增加。小龙虾存活率的检测结果表明RNAi下调prx 6基因表达量之后,其生存率显著低于dsGFP+S.aureus对照组。为了进一步探索死亡率升高的原因,研究了抗菌肽基因在抗细菌防御中的表达水平。RNAi实验结果显示,在prx 6基因表达量降低的情况下,小龙虾肝胰腺Pc-crustin 3、Pc-crustin 4、Pc-ALF 9以及Pc-lectin 1基因表达水平都出现了显著下降。此外,小龙虾血淋巴中的细菌载量检测结果显示,prx 6基因RNAi组的细菌载量显著高于dsGFP+S.aureus对照组。【结论】小龙虾prx 6基因通过影响抗菌肽基因的表达,以及血淋巴细菌清除能力来参与抗细菌先天免疫应答。

抗菌肽BLFcin6与不同磷脂膜之间相互作用的分子动力学模拟研究

抗菌肽具有广谱抗菌特性,有望成为抗生素较好的替代产品.研究抗菌肽的抗菌机制,可以为新型抗菌肽的设计提供指导.无论抗菌肽采用哪种抗菌机制,其首先要稳定地吸附到细胞膜之上.因此,本文利用分子动力学模拟方法比较了抗菌小肽BLFcin6与5种不同细胞膜之间的相互作用.对这5种细胞膜而言,小肽会很快结合在POPG膜和DPPC-CHOL膜的表面,倾向于进入DPPC膜的疏水内部,与POPC膜和POPC-CHOL膜的接触很少.考察相互作用能,小肽与POPG膜的相互作用最强,主要是小肽与细胞膜亲水头部存在静电相互作用;小肽与DPPC膜的疏水尾部的相互作用较强,但受胆固醇影响,小肽只结合在DPPC-CHOL膜表面.在结合过程中,小肽N端的Arg会先结合到细胞膜上,静电相互作用在小肽锚定细胞膜的过程中起关键作用.以上研究从原子水平上解释了为什么BLFcin6小肽具有抗菌作用,哪些残基起关键作用,也为进一步开展BLFcin6小肽及其衍生小肽的研究奠定基础.

抗菌肽-Mt6的理化特性和抗菌活性及联合抗真菌药物对白色念珠菌的作用

目的探讨抗菌肽-Mt6(AMPs-Mt6)的理化特性、抗菌活性及联合抗真菌药物对白色念珠菌(C.albicans)的作用。方法以家蝇抗真菌肽-1A(MAF-1A)为模板,采用氨基酸残基替换法设计AMPs-Mt6,并以生物信息学方法分析其理化特性;挑取对数生长期C.albicans、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、枯草杆菌(B.subtilis)、大肠埃希菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、甲型副伤寒沙门菌(S.paratyphi)及肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌落制备细胞悬液,取菌液100μL和相同体积不同终浓度(156.25~2500.00 mg/L)的AMPs-Mt6稀释液混匀,采用微量肉汤稀释法检测AMPs-Mt6对上述各菌属的最小抑菌浓度(MIC)、最小杀真菌浓度(MFC)及最小杀细菌浓度(MBC);取(0.5~2.5)×10^(6)cfu/L的C.albicans菌液100μL和相同体积不同终浓度(0.25~64.00 mg/L)的氟康唑(FLC)、两性霉素B(AmB)、伊曲康唑(ITC)及5-氟胞嘧啶(5-FC)药物稀释液混匀,采用微量肉汤稀释法检测上述各药物对C.albicans的MIC和MFC;采用棋盘格法检测AMPs-Mt6分别与FLC、AmB、ITC、5-FC联合使用时对C.albicans的体外抑制活性,并以部分抑菌浓度指数(FIC index)判定联合效应。结果AMPs-Mt6为带有9个正电荷数、疏水性为0.451、α-螺旋占比81%的两亲性多肽;AMPs-Mt6对C.albicans的MIC为312.50 mg/L,对所检测细菌均有抗菌作用,对S.aureus、B.subtilis及P.aeruginosa的MIC为625.00 mg/L,对E.coli、S.paratyphi、K.pneumoniae的MIC为1250.00 mg/L;AMPs-Mt6与AmB、ITC及5-FC联合时,FIC index值分别为0.19、0.36及0.37,表现为协同效应;AMPs-Mt6与FLC联合时,FIC index值为0.63,为相加效应。结论与模板肽MAF-1A相比,AMPs-Mt6的理化性质得到优化,抗菌活性和抗菌谱增强,与抗真菌药FLC、AmB、ITC及5-FC联用可增强各药物对C.albicans的抑杀效果。

6×His-tag在抗菌肽表达纯化中的应用及其对抗菌肽活性的影响

为方便抗菌肽的体外表达和纯化,以蝎子防御素为对象,在其编码基因末端加入6×His-tag,在酵母表达系统中表达,获得有活性的防御素Sd和融合蛋白Sd-His。进一步纯化、体外抑菌活性及热酸稳定性等试验发现,6×His-tag不但没有降低防御素的抑菌活性,反而有稍微的增强趋势。结果表明,6×His-tag可用于抗菌肽的融合表达且不影响其活性,为抗菌肽的表达纯化提供了一个更简便有效的方法。

纳豆芽孢杆菌NT-6酶解猪肉骨粉生产抗菌饲用肽的工艺优化

【目的】为提高抗菌脂肽和活性小肽产量,以猪肉骨粉为主要基质,研究利用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6生产抗菌营养饲用肽,并优化固态发酵和二次酶解工艺条件。【方法】考察固态发酵中肉骨粉与麸皮配比、稻壳添加量、初始基质水分含量和发酵时间对大肠杆菌抑菌率的影响,考察二次酶解中料水比、pH、酶解温度和酶解时间对小肽转化率的影响,通过单因素试验和响应面设计优化固态发酵及二次酶解工艺条件。【结果】最佳发酵工艺为:肉骨粉与麸皮配比7.96∶2.04,稻壳添加量1.58 g,水分含量59.95%,发酵时间99.10 h,大肠杆菌抑菌率可达87.10%;最佳酶解工艺为:料水比1∶2.35,pH 8.60,温度40.48℃,酶解时间2.91 h,小肽转化率可达21.26%。【结论】优化和明确了NT-6发酵酶解肉骨粉生产抗菌饲用肽的最佳工艺参数,为复合型抗菌营养活性饲用肽的商业化应用提供数据。

共表达猪IL-4/6与抗菌肽融合基因的重组酵母菌的生物活性及其对小鼠免疫增强作用研究

为开发高效安全经济的免疫调节剂,本研究构建了共表达猪IL-4/6和猪抗菌肽融合基因VRP的重组毕赤酵母SG46P。通过猪淋巴细胞增殖试验和抑菌试验检测其发酵上清液的生物学活性和抑菌活性,并用该重组毕赤酵母对30只21日龄雌性ICR小鼠进行灌胃接种。接种后,每周采集小鼠尾部静脉血进行免疫功能分析试验;并在第28 d用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行小鼠腹腔攻毒试验。结果显示:实验组SG46P的发酵上清液较对照组能显著刺激猪淋巴细胞的增殖(p<0.05),且该发酵上清液具有明显的抑菌作用(p<0.05)。接种重组毕赤酵母SG46P的小鼠的体质量有所增加(p>0.05)且其外周血中白细胞数量、血红蛋白含量均显著高于对照组(p<0.05);其血清中Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体水平均较对照组显著增加(p<0.05),其外周血中CD4+T和CD8+T淋巴细胞数量均显著高于对照组(p<0.05);TLR4、TLR9、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6、CD62L、IL-7、IL-23、CAMP和Crp4基因的转录水平均显著高于对照组(p<0.05)。攻毒后,接种SG46P的小鼠的生存率显著高于对照组(p<0.05)。结果表明:重组毕赤酵母SG46P不仅能够显著提高小鼠免疫基因的转录水平,有效提高动物的先天和获得性免疫水平,还可明显增强小鼠抗感染能力,这为研制高效安全经济的分子免疫调节剂和防治动物传染病开拓了新途径。

家蚕抗菌肽基因BmCecropinB6的克隆及重组蛋白的自诱导表达

【目的】家蚕CecropinB6(BmCecropinB6)是家蚕免疫防疫系统中1种重要的抗菌肽,对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有极强的抗菌作用,但对该重组抗菌肽的自诱导表达还未见报道。【方法】以家蚕中肠组织总RNA为模板,设计特异性引物,通过RT-PCR技术扩增BmCecropinB6基因,构建pET32a-BmCecropinB6原核表达载体,通过自诱导表达系统表达BmCecropinB6重组蛋白,并对表达产率进行分析。【结果】克隆的BmCecropinB6基因大小192 bp,编码63个氨基酸,自诱导表达的重组蛋白大小为27 ku,表达产率高达41%。【结论】该研究为BmCecropinB6抗菌肽的进一步应用奠定基础。

抗菌肽[L^6,K^(11)]-IsCT抑菌性能及其稳定性研究

IsCT最初是从蝎子中分离出的一种非细胞选择性线性抗菌肽,为了将其应用于动物饲料,需研究其对常见致病菌的抑制和杀灭作用。本试验采用微量稀释法和琼脂扩散法对ISCT衍生物[L6,K11]-IsCT的抗菌活性及其稳定性进行探索。结果显示,相对于金黄色葡萄球菌,[L6,K11]-IsCT对大肠杆菌具有更好的抑制作用,其对大肠杆菌的最小抑菌浓度为50μg/mL。另外,该衍生物对高温表现出很好的稳定性,同时具有很好的酸碱耐受性和人工胃液耐受性。经121℃、0.12 MPa处理30min,以及2.0≤pH≤11.0处理30min或人工胃液2h孵育处理后,依然能保持很好的抑菌活性。

抗菌抗内毒素多肽拮抗内毒素作用的体内研究

目的：观察抗菌抗内毒素多肽对内毒素(LPS)攻击大鼠的保护作用。方法：以一个LD50的LPS(10mg/kg^-1)攻击大鼠，于LPS攻击后20秒内静脉注射抗菌抗内毒素多肽(5mg/kg^-1)，在不同时相点采血，并测定大鼠血液中的TNT-α、IL-6浓度，以确定抗菌抗内毒素多肽对LPS攻击大鼠的保护作用。结果：抗菌抗内毒素多肽可明显降低LPS攻击大鼠血液中TNF-α、IL-6浓度。

血浆LL-37抗菌肽在支气管哮喘患儿发病中的作用研究

目的探究血浆LL-37抗菌肽、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原(KL-6)、白三烯(LTS)在支气管哮喘患儿发病中的作用研究。方法选择2015年1月～2016年12月于我院诊断与治疗的72例哮喘患儿、60例非喘息性肺炎患儿为研究对象,分别设为哮喘组、肺炎组,同时选取相同年龄的60例正常儿童,设为对照组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测三组儿童血浆LL-37抗菌肽、KL-6以及LTS水平。检查各患儿肺活量(FVC)、第1秒用力呼气量(FEV1)以及FEV1%,并进行相关性分析。结果三组LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平差异有统计学意义(P<0.05),哮喘组血浆LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平显著高于肺炎组与对照组,肺炎组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);三组FVC、FEV1、FEV1%差异有统计学意义(P<0.05),哮喘组FVC、FEV1、FEV1%显著低于肺炎组与对照组,肺炎组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);血浆LL-37抗菌肽与FVC、FEV1、FEV1%呈负相关(P<0.05),血浆KL-6与FVC、FEV1、FEV1%呈负相关(P<0.05),血浆LTS与FVC、FEV1、FEV1%呈负相关(P=0.000)。结论哮喘患儿血浆LL-37抗菌肽、KL-6水以及LTS水平均显著高于非喘息性肺炎患儿及正常儿童,与肺功能呈负相关,提示LL-37抗菌肽、KL-6、LTS与哮喘的发病及发展密切相关。

日粮中添加抗菌肽cecropin AD对肉鸡大肠杆菌攻毒条件下肠道菌群和白介素-6水平变代研究

试验旨在研究抗菌肽cecropin AD对肉鸡大肠杆菌K88攻毒状态下,日粮中添加抗菌肽对其肠道微生物和血浆IL-6的影响。试验选用1周龄AA肉公雏288只,随机分为3处理,每个处理8个重复。①空白对照:基础日粮;②抗生素组:基础日粮+80mg/kg金霉素;③抗菌肽组:基础日粮+300mg/kg的抗菌肽cecropin AD。试验期28d。第22d攻毒,各组肉鸡分别灌服1mL大肠杆菌K88的PBS菌悬液(109CFU/mL)。攻毒7d后,每个重复屠宰1只鸡,心脏采血并收集盲肠食糜。结果表明,与空白组相比,抗菌肽组能降低肠道大肠杆菌数目,乳酸杆菌数目没有显著变化,IL-6水平显著降低。试验结果表明,抗菌肽可以抑制大肠杆菌数目、控制炎性反应来保证肉鸡生产效率。

DC-CIK联合FOLFOX6化疗方案治疗老年结直肠癌患者的效果

目的:观察DC-CIK联合FOLFOX6化疗方案治疗老年结直肠癌患者的效果。方法:选取68例老年结直肠癌患者作为研究对象,采取随机数字表法分为对照组与观察组各34例。对照组给予FOLFOX6化疗方案治疗,观察组在对照组基础上加用DC-CIK方案治疗,比较两组患者临床疗效、不良反应发生率、治疗前后抗菌肽hCAP18、血清APE1自身抗体水平和随访1年生命质量提高率。结果:观察组治疗总有效率为85.29%,明显高于对照组的58.82%,差异有统计学意义(P<0.05)。两组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前,两组抗菌肽hCAP18、血清APE1自身抗体水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);治疗后,两组抗菌肽hCAP18、血清APE1自身抗体水平均低于治疗前,且观察组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组生命质量提高率为82.36%,高于对照组的58.82%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DC-CIK联合FOLFOX6化疗方案治疗老年结直肠癌患者可提高治疗总有效率和生命质量提高率,以及降低抗菌肽hCAP18水平和血清APE1自身抗体的效果优于单纯FOLFOX6化疗方案治疗效果。

基于转录组学分析Xenorhabdus bovienii肽基脯氨酰异构酶ppia-l20基因的表达调控

[目的]前期从广谱抗菌的Xenorhabdus bovienii NN6菌株的胞外蛋白中分离出一种新型杀菌蛋白PPIA-L20,为肽基脯氨酰异构酶A类似物,该蛋白能够抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型的孢子的萌发,致使孢子死亡。经过多次试验验证ppia-l20基因的表达水平不稳定,与发酵时间没有明显的相关性。本文旨在探寻调控ppia-l20基因表达的调控因子,进而推测ppia-l20基因表达调控的分子机制,为进一步提高抗菌蛋白的产量提供参考。[方法]对ppia-l20的转录水平进行Real-time PCR分析并与菌株生长曲线进行相关性分析,选择ppia-l20基因表达量差异显著的2个发酵时间点进行转录组学比较,并对表达差异显著的DEG(differential expressed gene)进行GO功能注释、KEGG富集通路和蛋白网络互作分析。[结果]4~84 h发酵菌体中的ppia-l20基因表达趋势不稳定,其转录水平与时间不相关。与ppia-l20低表达量的8 h发酵菌体相比,ppia-l20高表达量的12 h发酵菌体中有466个DEG,包括193个上调基因和273个下调基因。Real-time PCR验证表明基因表达差异趋势与转录组测序结果一致,证明测序结果可信。对差异表达的基因进行GO功能注释、KEGG富集分析,发现DEG的功能与膜形成相关,富集通路与双组分调节系统、磷酸转移酶系统和阳离子抗菌肽抵制通路相关。其中,双组分调节系统中的qseC基因和opmR基因表达量均上调2倍,ppia-l20基因位于阳离子抗菌肽抵制通路,该通路上的nlpE基因(负责编码外膜脂蛋白)显著下调。蛋白互作网络中,PPIA-L20蛋白与位于外膜的AMP结合蛋白TycC、GrsB有互作关系,NlpE蛋白与双组分调节系统中cpxR基因、cpxA基因表达的蛋白有互作关系。[结论]Xenorhabdus bovienii NN6菌株可能通过双组分调节系统通路、阳离子抗菌肽抵制通路上的关键基因nlpE和磷酸转移酶系统共同调控ppia-l20的表达。