小檗碱介导BMAL1:CLOCK复合体调控糖脂代谢改善脂肪胰岛素抵抗的效应机制

探究小檗碱介导脑和肌肉芳香烃受体核转位样蛋白1(brain and muscle arnt-like 1,BMAL1):昼夜自发输出周期蛋白kaput(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)复合体,调控糖脂代谢改善脂肪胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的作用机制。地塞米松诱导96 h建立IR-3T3-L1脂肪细胞模型,0.5、1、5、10、20μmol·L^(-1)小檗碱给药24 h。葡萄糖氧化酶法和细胞活性(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒分别检测胞外葡萄糖含量和细胞活力;酶比色法检测甘油三酯(triglyceride,TG)和甘油含量;油红O染色检测脂滴;荧光染色检测Ca2+、线粒体结构及活性氧(reactive oxygen species,ROS);蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测脂联素(adiponectin,ADPN)、BMAL1、CLOCK、激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase,HSL)、碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate-responsive element-binding protein,ChREBP)、固醇调节元件结合蛋白1C(sterol regulatory element-binding protein 1C,SREBP-1C)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1α(peroxisome proliferator activated receptorγcoactivator 1α,PGC1α)、肉碱棕榈酰基转移酶1α(choline phosphotransferase 1α,CPT1α)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptorsα,PPARα),免疫荧光检测BMAL1核定位。此外,添加20μmol·L^(-1)CLK8(CLOCK抑制剂)检测葡萄糖消耗量及BMAL1/ChREBP/PPARα蛋白。研究结果显示小檗碱增加IR-3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量,且不影响细胞活力;小檗碱降低IR-3T3-L1脂肪细胞胞内TG,5μmol·L^(-1)小檗碱升高甘油含量,减少脂滴积累,提示其加强脂解,而10μmol·L^(-1)小檗碱不影响甘油含量且脂滴更少,提示其可能同时加强脂解和甘油利用。此外,小檗碱降低IR-3T3-L1脂肪细胞胞内Ca^(2+)和ROS改善线粒体功能,上调PGC1α有助于维护线粒体结构。结果还显示小檗碱上调ADPN,提示其增加IR-3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性,上调外周节律调控蛋白BMAL1和CLOCK并增加BMAL1核定位,上调脂解关键蛋白HSL和脂氧化限速酶CPT1α,下调TG合成关键蛋白SREBP-1C,小檗碱同时上调IR-3T3-L1脂肪细胞ChREBP和PPARα,以上结果共同提示其促糖转脂增强降糖效应。鉴于CLK8特异性抑制CLOCK酰基化修饰BMAL1形成复合体,结果显示CLK8添加小檗碱可降低葡萄糖消耗量,提示小檗碱上调BMAL1:CLOCK复合体改善糖代谢。CLK8添加小檗碱组上调BMAL1但下调ChREBP和PPARα,因而推测小檗碱介导BMAL1:CLOCK复合体调控细胞糖脂代谢减轻脂肪细胞IR。