布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BMEI1135基因缺失株的构建及鉴定

为了初步探讨BMEI1135基因在布鲁氏菌感染过程中的作用,以16M为模板利用同源重组和抗性替换的方法,构建羊种布鲁氏菌16M(简称16M)BMEI1135基因缺失株(16M△BMEI1135)。将亲本株16M、疫苗株M5-90、缺失株16M△BMEI1135在相同起始浓度下震荡培养,观察其生长变化趋势;将各菌株置于强酸、强碱、高盐、热休克应激条件下,观察其生存率;侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,比较其在胞内的生存能力,并在不同时间点收集细胞提取RNA,通过qRT-PCR检测自噬相关基因的表达。研究结果显示:成功获得了布鲁氏菌BMEI1135基因缺失株且20代内未发生回复性突变现象。与亲本株相比,16M△BMEI1135在体外培养生长趋势与亲本株相似,只是细菌的浓度存在一定差异;突变株体在外界应激条件下生存能力低于亲本株;胞内CFU显示侵染4 h后缺失株胞内细菌数量明显下降(P<0.01);qRT-PCR检测到突变株的ULKI、Beclin1表达量均显著降低(P<0.01)。本实验的研究结果表明:布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M的胞内生存介导的细胞自噬密切相关,该研究为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。