中国明对虾BMP-7基因的克隆及表达模式分析

为探明转化生长因子-β (TGF-β)超蛋白家族的成员之一骨形态发生蛋白7 (BMP-7)基因在中国明对虾肌肉发生和生长过程中的表达模式,通过cDNA末端快速扩增技术得到了中国明对虾BMP-7基因(FcBMP-7基因)2003 bp的全长cDNA,包含466 bp的5′非翻译区和295 bp的3′非翻译区,1242 bp的开放阅读框共编码413个氨基酸。利用实时荧光定量PCR技术分析FcBMP-7基因在中国明对虾幼体原肠期、无节幼体期、溞状幼体期、糠虾幼体期、仔虾期5个不同发育时期肌肉组织中的表达规律,结果显示,该基因在幼体发育的各时期均有表达,原肠期表达量最低,从无节幼体期开始表达量显著增加(P<0.05),糠虾期表达水平最高,表明FcBMP-7基因参与了幼体肌肉的发生过程。此外,进一步分析FcBMP-7基因在中国明对虾2种规格幼虾[(3.95±0.08) g和(1.55±0.12) g]的8种组织中的表达模式,结果显示,FcBMP-7基因具有组织表达广泛性,且两组间的大部分组织的表达量均存在显著差异(P<0.05)。试验结果表明,FcBMP-7基因可能作为调节因子参与了中国明对虾幼体肌肉发生和幼虾肌肉生长过程,研究结果可为进一步解析中国明对虾肌肉发生发育的分子机制提供重要的理论资料。

多浪羊BMP7基因克隆、生物信息学分析及其在不同初情期阶段组织表达分析

【目的】对多浪羊骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP7)基因序列进行克隆和生物信息学分析,并检测多浪羊在初情期3个阶段5个组织中的表达规律,为探究BMP 7基因在多浪羊初情期中的生物学功能提供参考。【方法】采用PCR扩增多浪羊BMP 7基因序列并克隆测序,利用Mega 7.0软件构建系统发育树,利用生物信息学软件分析BMP7蛋白的理化性质和结构功能;采用实时荧光定量PCR检测BMP 7基因在初情期前、初情期、初情期后多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫5个组织中的表达量。【结果】试验成功获得多浪羊BMP 7基因序列长1334 bp,其中编码区长1296 bp,编码431个氨基酸,与绵羊和牛的亲缘关系最近,其次是人、猴、马,与小鼠和犬的亲缘关系最远。生物信息学分析显示,BMP7蛋白分子式为C_(2200)H_(3374)N_(632)O_(628)S_(17),理论等电点(pI)为8.17,原子总数为6851个,不稳定指数为53.18,脂溶性系数76.96,总平均亲水性为―0.419,为不稳定亲水碱性蛋白;二级结构主要以α-螺旋及无规则卷曲为主,三级结构预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR检测显示,BMP 7基因在多浪羊初情期前、初情期、初情期后均有表达,其中在下丘脑中表达量显著高于其他组织(P<0.05);在初情期前到初情期的下丘脑和子宫中BMP 7基因表达量显著上升(P<0.05),初情期到初情期后BMP 7基因表达量显著下降(P<0.05)。【结论】试验成功克隆了多浪羊BMP 7基因序列,该基因在多浪羊初情期前后3个不同阶段的5个组织中均有表达,结果为探究BMP 7基因在多浪羊初情期中的作用提供了参考。

人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况。方法用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测。结果酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25×1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体。

人BMP-7及VEGF基因共表达腺病毒的构建及在兔骨髓基质干细胞中的共表达

目的构建人BMP7及VEGF165基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达。方法利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP7及VEGF165基因共表达腺病毒AdB7V,体外感染rBMSC后通过观察绿色荧光蛋白表达及RTPCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达。结果rBMSC经AdB7V感染后72h可观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,RTPCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP7及VEGF165基因均可在rBMSC中表达。结论成功构建人BMP7及VEGF165基因共表达重组腺病毒,证实了其在rBMSC的表达,为骨再生的局部联合基因治疗打下基础。

人骨形成蛋白-7基因在人骨髓间充质干细胞中的表达和对其分化表型的影响

目的 :观察人骨形成蛋白 7(BMP 7)基因在人骨髓间充质干细胞 (hMSC)中的表达及对其成骨表型的影响。 方法 :利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP 7基因表达腺病毒AdB7V ,体外感染hMSC后观察绿色荧光蛋白(GFP)表达及RT PCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达 ,通过对感染细胞的碱性磷酸酶 (ALP)染色和钙盐染色鉴定其成骨分化表型。 结果 :hMSC经AdB7V感染后 72h可观察到GFP表达 ,RT PCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP 7在hMSC中表达 ,感染细胞的ALP染色和钙盐染色均为阳性。 结论 :外源性的人BMP

人骨形成蛋白-7基因重组腺病毒的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的 :克隆人骨形成蛋白 7(BMP 7)基因并构建其重组腺病毒 ,观察其在兔BMSc中的表达 .方法 :用RT PCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP 7基因全长cDNA并测序 ;将BMP 7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAd Track CMV BMP 7,经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier 1Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP 7并酶切鉴定 ,PacI酶切线性化后转染 2 93细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP 7,将AdBMP 7体外感染兔BMSc后 ,以RT PCR方法及观察AdEasy系统上的绿色荧光蛋白表达鉴定BMP 7基因的表达 .结果 :用RT PCR方法从胎肾组织中克隆出 1 2 96bp的cDNA ,测序证实为人BMP 7基因 ;酶切鉴定表明BMP 7基因已插入到 pAd Track CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒 pAdBMP 7构建成功 ;经 2 93细胞包装 3d后可观察到绿色荧光蛋白表达(GFP) ,氯化铯梯度离心法最终获得约 3× 1 0 9efu/L滴度的重组病毒 ;体外感染兔BMSc后RT PCR方法及荧光显微镜证实BMP 7基因可在兔BMSc中表达 .结论 :成功克隆人BMP 7基因并构建其重组腺病毒 ,证实了其在BMSc的表达 。

辛伐他汀诱导促进骨形成蛋白-7基因修饰的兔间充质干细胞的成骨转化

目的:研究辛伐他汀诱导对骨形成蛋白-7(BMP-7)基因修饰的间充质干细胞(MSCs)增殖和分化表型的影响。方法:将辛伐他汀诱导和未经诱导的兔MSCs分别转导BMP-7基因后,Westernblotting检测转导后细胞BMP-7的表达;通过观察细胞生长以及碱性磷酸酶活性和测定骨钙素含量,分析辛伐他汀诱导对BMP-7基因修饰的MSCs的增殖和分化表型的影响。结果:转导后BMP-7基因在诱导组和未诱导组MSCs中均有表达,诱导组细胞BMP-7表达量、碱性磷酸酶活性和骨钙素含量均比较未诱导组明显增高。结论:转导前辛伐他汀诱导能够促进BMP-7基因修饰的MSCs的成骨转化。

人骨形态发生蛋白-7全长基因cDNA的克隆和序列分析

目的 克隆人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)全长基因,并进行测序及序列分析,研究其结构和功能。方法 采用异硫氰酸胍一步法从人胎儿肾中提取总RNA,利用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,分段扩增出hBMP-7全长基因cDNA,与PGEM-Teasy连接成PGEM-Teasy/hBMP-7重组质粒,采用Sanger双脱氧链终止法测定基因序列。结果以4号特异引物引导的RT-PCR扩增出BMP-7基因3′端540bp片段,以2号特异引物引导的RT-PCR扩增出BMP-7基因5′端750bp片段,重组连接两片段得到BMP-7全长基因cDNA。与Genebank上发表的hBMP-7序列(XM30619)比较有一个碱基不同,第862位核苷酸由T→G,编码的氨基酸由苯丙氨酸变为缬氨酸。结论 首次从中国人胎肾中分段克隆出BMP-7全基因。cDNA,该基因在骨关节系统的损伤与修复中具有重要的临床应用价值。

重组hBMP-7转染ADSCs分化成骨修复兔缺血性股骨头坏死

[目的]观察重组h BMP-7转染ADSCs分化成骨修复兔股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head,ANFH)的疗效。[方法]设计和合成引物通过PCR扩增h BMP-7基因。取4只3个月龄新西兰大白兔颈背部皮下脂肪组织分离脂肪细胞并培养传代。将h BMP-7经脂质体介导转染3代脂肪干细胞。36只新西兰大白兔ANFH模型随机分为3组。A组为模型对照组,B组为模型对照组处理的基础上减压后植入空质粒ADSCs;C组为模型对照组处理的基础上减压后植入重组h BMP-7真核表达载体转染的ADSCs。观察股骨头坏死模型兔的一般情况,并分别于术后4、8周每组处死6只行骨密度检查,收集到的模型股骨头标本分别行X线检查、HE染色及免疫组化检测BMP-7表达,检测ANFH修复重建的效果。[结果]术后第4周三组股骨近端骨密度变化分别为A组骨质疏松,B组和C组均为骨量减少,C组较B组骨质情况稍好但差异无统计学意义。术后第8周,三组骨密度C>B>A,差异有统计学意义。其他:4周时,X线检查,组织学检查A,B,C组的修复效果分别为C及B>A,但C、B两组间差异无统计学意义。BMP-7免疫组化的表达量为C>B>A。8周时,组织学检查A,B,C组的修复效果分别为C>B>A,BMP-7免疫组化的表达量也为C>B>A。[结论]经过h BMP-7转染修饰的ADSCs植入坏死的股骨头内成骨能力及修复坏死区域的功能较单独ADSCs强,具有应用于临床修复股骨头坏死的理论基础。