miR-210-5p对小鼠脂肪干细胞成骨分化的影响及作用机制分析

[目的]观察miR-210-5p在小鼠脂肪干细胞增殖和成骨分化中的作用并探讨其作用机制.[方法]将小鼠脂肪干细胞分空白对照组、miR-210-5p模拟物阴性对照组、miR-210-5p模拟物组、miR-210-5p抑制物阴性对照组和miR-210-5p抑制物组,采用CCK-8细胞计数法检测细胞增殖能力,茜素红染色观察钙盐矿化结节形成能力,用实时荧光定量PCR检测miR-210-5p水平及成骨分化标志物BMP2、Smad1、Smad5和Runx2 mRNA表达水平,进而用蛋白免疫印迹法检测BMP2、Smad1、Smad5和Runx2蛋白表达水平.[结果] miR-210-5p模拟物组细胞增殖活力显著升高(P<0.01),矿化结节显著增加,BMP2、Smad1、Smad5和Runx2 mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.01);miR-210-5p抑制物组细胞增殖活力显著降低(P<0.01),矿化结节显著降低,BMP2、Smad1、Smad5和Runx2 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.01).[结论] miR-210-5p可能通过调控BMP2/Smad信号通路促进小鼠脂肪干细胞增殖和成骨分化.

IGF1通过BMP2-Smad1/5信号通路调控犬上颌窦黏膜干细胞成骨分化

目的探讨骨形态形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP2)-Smad1/5及p38MAPK信号通路在胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)介导的促犬上颌窦黏膜干细胞(maxillary sinus membrane stem cells,MSMSCs)成骨分化中的作用。方法构建表达胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor1,IGF1)基因的重组腺病毒载体(recombinant adenovirus,rAdv)Ad-IGF1。感染Ad-IGF1的犬上颌窦黏膜干细胞,经成骨诱导培养后,qRT-PCR和Western blot检测BMP-Smads信号通路中重要信号蛋白Smad1/5的磷酸化水平和BMP2蛋白的表达;免疫组化观察磷酸化Smad1/5核转位情况;qRT-PCR及Western blot检测BMP-Smads通路抑制剂Noggin和p38MAPK信号通路抑制剂SB203580对IGF1介导的促犬MSMSCs成骨分化的影响。结果成功构建IGF1基因表达重组腺病毒载体Ad-IGF1;感染Ad-IGF1的犬MSMSCs,经成骨诱导培养后,Smad1/5的磷酸化水平和BMP2蛋白的表达升高,IGF1可促使Smad1/5核转位;BMP-Smads信号通路抑制剂Noggin可抑制Smad1/5的磷酸化,降低成骨标志物Runx2、OPN和ALP mRNA的表达,钙结节形成减少。p38MAPK信号通路抑制剂SB203580不能降低Ad-IGF1犬MSMSCs的p38磷酸化水平,亦不能降低成骨标志物Runx2、OPN和ALP mRNA的表达。结论犬MSMSCs成骨分化过程中,IGF1通过经典的Smads蛋白依赖性信号转导通路BMP2-Smad1/5促进成骨,而Smads蛋白非依赖性信号转导通路p38MAPK在IGF1介导的犬MSMSCs成骨过程中可能并不发挥作用。

基于BMP/Smads/Runx2信号通路探讨桃红四物汤对创伤性股骨头坏死模型大鼠成骨化表达和病理形态学的影响

目的:观察桃红四物汤对创伤性股骨头坏死模型大鼠病理形态与BMP2、Smad1/5/8、Runx2蛋白及mRNA表达的影响,并探讨可能作用机制。方法:将35只SD大鼠采用完全随机分组法分成空白组、模型组、桃红四物汤高剂量组、桃红四物汤中剂量组、桃红四物汤低剂量组,每组7只。除空白组外,其余各组大鼠均采用股骨头血供剥离法造模;造模4周后,每组随机抽取1只大鼠处死,取术侧股骨以大体观察验证造模成功;验证造模成功后,桃红四物汤低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予相应药物,空白组及模型组大鼠灌胃等容量生理盐水,2次/d,连续灌胃6周。取大鼠股骨头骨组织,采用HE和Masson染色观察骨组织细胞病理情况,采用Western blotting检测骨组织BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Runx2蛋白表达情况,采用RT-PCR检测细胞内BMP2 mRNA、Smad1 mRNA、Smad5 mRNA、Smad8 mRNA、Runx2 mRNA表达情况。结果:与空白组比较,模型组大鼠股骨头病理形态发生破坏和病变,钙流失、骨结构破坏增加及造血细胞减少,骨组织中BMP2、Smad1/5/8、Runx2蛋白相对表达量降低,组织细胞中的BMP2 mRNA、Smad1/5/8 mRNA、Runx2 mRNA相对表达量下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,桃红四物汤低、中、高剂量组大鼠股骨头钙化组织、骨小梁、造血细胞等病理形态均有改善;与模型组比较,桃红四物汤高剂量组大鼠股骨头空骨陷窝率、IOD/Area比值明显降低(P<0.05);与模型组比较,桃红四物汤低、中、高剂量组大鼠股骨头骨组织BMP2、Smad1/5/8、Runx2蛋白相对表达量明显升高,组织细胞中的BMP2 mRNA、Smad1/5/8 mRNA、Runx2 mRNA相对表达量上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。桃红四物汤低、中、高剂量组大鼠股骨头病理形态变化改善程度、骨组织BMP2、Smad1/5/8、Runx2蛋白相对表达量及组织细胞中的BMP2 mRNA、Smad1/5/8 mRNA、Runx2 mRNA相对表达量的升高呈现明显量效关系。结论:桃红四物汤可以提高创伤性股骨头坏死模型大鼠BMP2、Smad1/5/8、Runx2蛋白及mRNA相对表达量,改善大鼠模型股骨头的病理形态,其机理可能与BMP2/Smads/Runx2信号通路激活有关。

基于BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信号通路探讨健骨颗粒氯仿萃取部位对体外成骨细胞分化的影响

目的:通过观察健骨颗粒氯仿萃取部位对体外培养成骨细胞的影响,研究其调控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信号通路影响成骨细胞分化的可能机制。方法:选用年龄<3 d的BALB/c小鼠,从其颅盖骨提取原代成骨细胞,并采用碱性磷酸酶染色法对所提取的细胞进行鉴定;取生长状态良好的第3代成骨细胞作为实验对象,将健骨颗粒氯仿萃取部位稀释至不同的浓度梯度,即设置0、2、4、8、16、32、64 ng/mL 7个药物浓度组对细胞进行干预,采用MTT法筛选健骨颗粒氯仿萃取部位促进成骨细胞增殖的最佳浓度,作为最佳药物干预浓度进行后续实验。取第3代细胞,将其分为空白组、抑制剂组(BMP2抑制剂Noggin干预)、药物组(健骨颗粒氯仿萃取部位干预)和抑制剂加药物组(Noggin加健骨颗粒氯仿萃取部位干预),按组别干预后进行后续实验。采用RT-PCR检测各组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及成骨细胞分化相关基因ALP、CollagenⅠmRNA的表达水平;采用Western blot法检测各组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及ALP、CollagenⅠ的蛋白表达,观察健骨颗粒氯仿萃取部位对成骨细胞分化的影响。结果:经碱性磷酸酶染色法鉴定,所提取的原代细胞阳性率高达90%为成骨细胞;采用MTT法检测发现健骨颗粒氯仿萃取部位在药物浓度为32 ng/mL时,成骨细胞增殖速度最快,在干预2 d时达到增殖高峰,故选用32 ng/mL干预2 d作为健骨颗粒氯仿萃取部位最佳干预浓度进行后续实验;RT-PCR与Western blot检测结果显示,与空白组相比,抑制剂组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及ALP、CollagenⅠ各指标基因表达水平显著降低,蛋白相对表达量明显降低(P<0.01或P<0.05);与空白组相比较,药物组6个指标基因表达水平显著升高,蛋白相对表达量也明显升高(P<0.01或P<0.05);抑制剂加药物组与抑制剂组比较,各指标基因表达水平和蛋白相对表达量均显著升高(P<0.01或P<0.05)。结论:(1)使用Noggin抑制细胞内BMP2的表达后,Smad1、Runx2、Osterix的基因和蛋白的表达明显下降,与此同时成骨细胞分化相关指标ALP、CollagenⅠ基因和蛋白表达也明显下降,提示BMP2通路与成骨细胞分化密切相关。(2)健骨颗粒氯仿萃取部位干预原代成骨细胞后能够升高细胞内BMP2、Smad1、Runx2、Osterix与成骨细胞分化相关指标ALP、CollagenⅠ基因和蛋白的表达,促进成骨样细胞分化;提示健骨颗粒氯仿萃取部位可以通过调控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix通路,促进成骨细胞分化,从而达到防治绝经后骨质疏松症的作用。

阿仑膦酸钠对成骨细胞BMP-2信号通路的影响

二膦酸盐不仅特异性抑制破骨细胞,同时对成骨细胞也起一定的作用.用酶消化法取乳鼠颅盖骨进行成骨细胞培养,分为空白对照组、阿仑膦酸钠高、中、低剂量组.从BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信号通路角度观察二膦酸盐对成骨细胞分化的作用.结果显示:比色法结果显示干预2和4d后各剂量阿仑膦酸钠组的碱性膦酸酶(AKP)显著增加,其中中剂量组表达最高,各组明显高于空白对照组(p<0.05),第6天各剂量阿仑膦酸钠组AKP逐渐下降,与空白对照组比较,无统计学意义(p>0.05);ELISA结果显示随着天数增加各剂量阿仑膦酸钠组的BMP-2逐渐增加,其中中剂量组表达最高,各组明显高于空白对照组(p<0.05),干预2和4d后各剂量阿仑膦酸钠组的I型胶原(Collagen Type I)显著增加,其中中剂量组表达最高,各组明显高于空白对照组(p<0.05),第6天各剂量阿仑膦酸钠组Collagen Type I逐渐下降,空白对照组随着天数逐渐增加,但均低于同时期用药组(p<0.05);荧光定量PCR(qPCR)检测结果显示BMP-2、Smad1/5、Runx2和Osterix mRNA表达在干预后,随着时间的延长,逐渐上升;阿仑膦酸钠组的含量高于同期的空白对照组.提示阿伦膦酸钠能刺激成骨细胞增殖,增强BMP、AKP活性,通过BMP-2/Smads/Runx2/Osterix通路上调相关基因表达,促进成骨细胞分化.

雷奈酸锶通过骨形态发生蛋白-2/Smad通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）/Smad通路在雷奈酸锶（Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为成骨细胞过程中的作用。方法体外分离培养大鼠BMSCs,根据实验目的加入不同浓度Sr、BMP-2的拮抗剂noggin及Smad1小干扰RNA（SiRNA）。酶标法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色检测钙结节,Western blotting法检测磷酸化Smad1/5/8及Runt相关转录因子-2（Runx2）蛋白的表达。结果应用0.1~10 mmol/L Sr处理BMSCs细胞1 h后,细胞内磷酸化Smad1/5/8表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h能抑制Sr对磷酸化Smad1/5/8表达的上调作用;应用0.1~5 mmol/L Sr处理细胞6 h后,细胞内Runx2表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用Smad1 SiRNA转染细胞后能下调Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8的表达,并抑制Sr对Runx2表达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论 BMP-2/Smad通路参与了Sr促进BMSCs成骨分化。

BMP-2信号通路与成骨细胞分化

骨形态发生蛋白(BMP)-2与多种细胞因子形成BMP-2信号通路,促进成骨细胞分化和骨细胞外基质合成与分泌,多种细胞因子则通过调节BMP-2信号通路影响骨代谢。该文就BMP-2两条重要信号通路BMP-2/Smads/Runx2/Osterix、BMP-2/Smads/Msx2/Osterix与成骨细胞分化的近年研究进展作一综述。

淫羊藿总黄酮调控miR-34a-5p保护成骨细胞脂多糖诱导性损伤的作用机制

目的探讨淫羊藿总黄酮(total flavones of epimedium,TFE)调控miR-34a-5p保护脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的成骨细胞损伤的作用机制。方法建立LPS诱导的大鼠成骨细胞模型,给予TFE含药血清,MTT法检测成骨细胞活性。构建荧光素酶报告基因,检测荧光活性,脂质体瞬时转染miR-34a-5p模拟物和抑制剂。RT-PCR分析转染前后miR-34a-5p、SMAD2、ALP、RUNX2mRNA的表达,Western blot检测SMAD2、RUNX2、ALP蛋白表达。结果TFE能提高LPS诱导的成骨细胞活性,促进RUNX2、ALP蛋白表达(P<0.01)。TFE在LPS诱导的成骨细胞中可促进miR-34a-5p的表达,抑制SMAD2的mRNA及蛋白表达水平。miR-34a-5p转染细胞后,显著降低荧光素酶报告基因的活性,促进成骨细胞RUNX2、ALP的蛋白表达。抑制miR-34a-5p可促进成骨细胞SMAD2mRNA及蛋白表达,并抑制成骨因子的表达(P<0.05),逆转了TFE对LPS诱导的成骨细胞损伤的保护作用。结论TFE通过调控miR-34a-5p与SMAD2相互作用,减轻LPS诱导的成骨细胞损伤。

绝经后骨质疏松患者胎球蛋白-基质gla蛋白-钙磷矿化复合物的作用机制研究

目的探讨胎球蛋白-基质gla蛋白-钙磷矿化复合物（FMC）在绝经后骨质疏松症（PMOP）患者发病中的作用机制。方法分别选择PMOP患者（PMOP组）和骨量正常者（非骨质疏松组）各23名,采用双能X线吸收法（DEXA）测定腰椎骨密度（BMD）,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清胎球蛋白A（fetuin-A）、基质gla蛋白（matrix gla protein,MGP）、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein,BMP2）、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor-2,Run X2）水平,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测骨组织局部fetuin A、MGP、BMP2、Run X2mRNA表达。结果 PMOP组血清Fetuin-A、MGP、腰椎BMP2、Run X2 mRNA表达明显低于非骨质疏松组,而腰椎MGPmRNA表达高于非骨质疏松组（P〈0.05）;组间比较,血清BMP2、Run X2水平、腰椎Fetuin-A mRNA表达,均差异无统计学意义（P〉0.05）。多元逻辑回归分析显示,腰椎MGP、BMP2及Run X2 mRNA表达与BMD相关（OR 1.016,95%CI0.809~0.991,P=0.029;OR 1.230,95%CI 1.063~1.424,P=0.015;OR 1.107,95%CI 1.016~1.205,P=0.048）。结论血清FMC合成的减少及MGP在局部骨组织聚集,可能通过影响BMP2/Smad/Run X2信号通路,抑制正常的骨矿化,从而导致PMOP的发生。

银杏叶提取物对瓣膜间质细胞钙化的保护作用

目的:研究银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,EGB761)对华法林诱导的主动脉瓣膜间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVIC)钙化及成骨分化的保护作用。方法:分离猪AVIC,将不同浓度的EGB761作用于AVIC,通过茜素红染色、细胞内钙含量以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测观察EGB761对猪AVIC钙化的作用。Real-time PCR和Western blot检测成骨分化相关基因Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、Msx2(msh homeobox 2)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)和磷酸化Smad1/5的表达。结果:EGB761显著抑制华法林诱导的AVIC钙化,成骨分化相关基因Runx2、Msx2、BMP2的m RNA表达减低,Smad1/5磷酸化及Runx2蛋白表达被抑制。结论:EGB761可能是通过下调Smad1/5磷酸化水平,抑制BMP2/Smad1/5/Runx2信号通路,从而缓解了AVIC钙化和成骨分化。

谷红注射液促大鼠骨折愈合的作用及机制研究

目的观察谷红注射液(guhong injection,GHI)对大鼠胫骨骨折愈合的促进作用,并探讨其作用的相关机制。方法雄性SD大鼠180只随机分成6组,每组30只:假手术组、模型组、阳性药组(复方骨肽注射液,5 m L·kg-1)和GHI低、中、高剂量组(2. 5、5、10 m L·kg-1)。除假手术组外,其余各组建立胫骨骨折大鼠模型。造模后各组行每日1次腹腔注射给药并于1、2、4和6周末取样,心脏取血行血液生化分析和ELISA试剂盒检测;完整取出胫骨行X线摄片、骨生物力学检测、免疫组化法和RT-PCR法。结果 (1)给药1、2和4周末,GHI中、高剂量组的血清钙(Ca)、磷(P)含量高于模型组(P <0. 05)。(2)X线摄片显示,GHI各剂量组的外骨痂增长和骨折线消失较模型组快。(3)与模型组相比,GHI中、高剂量组的最大抗折力、刚性系数均上升(P <0. 05)且受力折线图趋势改善明显。(4)与模型组相比,GHI中、高剂量组的碱性磷酸酶(ALP)含量较高(P <0. 05); GHI各剂量组血清中血小板衍生因子(PDGF)有不同程度的上升(P <0. 05或P <0. 01);给药1、2和4周末,GHI各剂量组血清中骨形态发生蛋白(BMP)-2上升(P <0. 05或P <0. 01)。(5)与模型组相比,GHI中、高剂量组大鼠骨痂中Runx2 mRNA表达上升且Smad5蛋白表达上升(P <0. 05或P <0. 01)。结论 GHI能明显改善骨折大鼠骨骼的生物力学性能,其促进骨折愈合的作用可能是通过上调PDGF、BMP-2在骨愈合不同阶段的表达,调控BMP/Smad5/Runx2信号通路可能是其促骨折愈合的机制之一。