系统性红斑狼疮模型鼠骨BMP/Smads信号通路状态的研究

目的 :探讨狼疮鼠(MRL/lpr)骨BMP/Smads信号通路表达情况。方法 :分离小鼠股骨制备组织切片,常规苏木素-伊红(HE)染色,观察骨质情况;免疫组化观察骨组织中骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)表达;密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞(bone marrow masenchymal stem cells,BMMSCs),细胞爬片后免疫荧光法观察BMP-2、p-Smad1/5/8蛋白表达情况;BMP-2诱导BMMSCs向成骨细胞分化,RT-PCR法检测BMMSCs ALP、Runx2基因m RNA水平,ALP染色鉴定早期成骨情况。结果:狼疮鼠骨皮质较正常鼠减少,皮质骨占骨体积比例较正常鼠减低(P<0.01);狼疮鼠股骨BMP-2表达与正常鼠无明显差别(P>0.05);细胞免疫荧光显示狼疮鼠BMMSCs BMP-2、p-Smad1/5/8表达减弱(P<0.05);狼疮鼠BMMSCs BMP-2刺激7 d后ALP活性较正常鼠减低,BMP-2刺激3 d后ALP m RNA水平较正常鼠减弱(P<0.01),Runx2 m RNA水平较正常鼠无明显差别(P>0.05)。结论 :狼疮鼠骨BMP/Smads信号通路处于抑制状态。

肾衰泄浊汤对BMP7/TGFβ1/Smads信号通路的调节作用

目的:观察肾衰泄浊汤对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织骨形态蛋白-7(BMP7)、转化生长因子β1(TGFβ1)/Smads信号通路的调节作用。方法:将72只大鼠随机分为:假手术组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、苯那普利组,采用单侧输尿管梗阻动物模型,术后第7、14d分别观察梗阻侧大鼠肾组织病理改变及BMP7、Smad2、Smad6、TGFβ1,Ⅰ、Ⅲ型胶原及FN蛋白表达。结果:各治疗组大鼠肾组织Ⅰ、Ⅲ型胶原,FN、Smad2、TGFβ1蛋白表达较模型组明显减弱,但较假手术组显著增强;而各治疗组大鼠肾组织BMP7、Smad6蛋白表达则相反,以中药高剂量组效果最明显。且BMP7、Smad6与TGFβ1呈明显负相关;Smad2与TGFβ1呈明显正相关。结论:肾衰泄浊汤可能是通过诱导BMP7、Smad6蛋白表达,抑制Smad2蛋白表达,调节BMP7/TGFβ1/Smads信号通路,抑制TGFβ1蛋白表达,从而抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原及FN等ECM的过度沉积,减轻肾间质的纤维化。其治疗效果明显优于苯那普利。

BMP4诱导的Smad9在小鼠卵泡发育中的作用及其机制的初步研究

本研究旨在探讨Smad9在小鼠卵泡发育中的作用,为卵泡生长发育及其调控机制的研究提供新思路。将6周龄的雌性昆明小鼠随机分成3组,分别腹腔注射生理盐水、骨形态发生蛋白-4(BMP4)和Smad9抑制剂(LDN-193189),依次作为对照组、BMP4组和LDN组。48h后收集卵巢制作石蜡切片,HE染色后观察卵泡发育情况并对各级卵泡进行计数;采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测Smad9蛋白和mRNA水平。同时通过ELISA试验测定各组小鼠血清中雌二醇(E2)、孕酮(P4)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和芳香化酶等的浓度,并检测了CYP19a1、LHR、PRLR和FSHR基因的表达情况,进一步探究Smad9可能的作用机制。结果显示,与对照组相比,BMP4组Smad9蛋白和mRNA水平较高,而LDN组较低;BMP4组有腔卵泡显著增加(P<0.05),而LDN组显著减少(P<0.05)。此外,ELISA试验结果显示,BMP4组血清E2、FSH和芳香化酶含量增加,而P4和LH含量降低;LDN组中E2和芳香化酶的含量降低。实时荧光定量PCR结果显示,BMP4组FSHR和CYP19a1基因的mRNA水平升高,而LHR和PRLR基因的mRNA水平降低;LDN组PRLR基因的mRNA水平升高,而CYP19a1基因的mRNA水平降低。由以上试验结果可以得出,BMP4诱导的Smad9能促进小鼠有腔卵泡的发育,而其可能主要通过影响E2、PRL和芳香化酶等的产生而起作用。

PTEN在骨形态发生蛋白9诱导小鼠胚胎成纤细胞骨向分化中的作用

目的研究PTEN对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化的影响,并分析PTEN调节BMP9功能的可能机制。方法采用定量PCR检测PTEN在间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达,分析在MEFs中BMP9对PTEN表达的影响。采用组织化学染色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,PCR检测OPN和OCN的表达水平,茜素红染色检测钙盐沉积,分析PTEN对BMP9诱导MEFs成骨分化的影响;利用荧光素酶报告质粒和蛋白印迹等方法分析PTEN对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)/Smads信号转导的影响。结果 PTEN在几种常见MSCs中均有表达;BMP9在MEFs中明显抑制PTEN的表达。抑制PTEN能促进BMP9诱导MEFs的ALP活性增加,但过表达PTEN对BMP9诱导MEFs的ALP活性有明显抑制作用。抑制PTEN明显促进BMP9在MEFs细胞中诱导的OCN表达,并增强钙盐沉积。报告质粒分析结果显示,抑制PTEN能明显增强BMPR-Smad报告质粒的转录活性,并增加Smad1/5/8的磷酸化水平。结论下调PTEN表达可能是BMP9诱导MEFs成骨分化重要途径之一,其机制可能与促进BMPs/Smads信号转导有关。

阿魏酸治疗对去卵巢雌性大鼠骨量流失的保护作用机制研究

目的研究阿魏酸(ferulic acid)对去卵巢大鼠骨量流失的影响,并探讨可能的机制。方法通过双侧去卵巢建立骨质疏松大鼠模型;随后随机分为假手术组(Sham)、去卵巢组(OVX)以及阿魏酸组,每组10只;其中阿魏酸组大鼠每天给予阿魏酸(20 mg/kg)灌胃治疗;待12周治疗结束后使用Micro-CT、HE染色切片、骨代谢指标、骨生物力学检测以及蛋白质印迹观察治疗效果以及探讨可能的机制。结果治疗12周后,与OVX组相比,Micro-CT和HE染色切片结果显示阿魏酸组的大鼠骨小梁数量和骨密度(bone mineral density,BMD)得到明显改善。阿魏酸组大鼠BMD、TV/BV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp较OVX组明显改善(P<0.05)。治疗12周时,阿魏酸组极限载荷和刚度较OVX组显著增加(P<0.05),而阿魏酸组骨代谢指标P1NP和TRACP-5b水平显著降低(P<0.05),比较差异有统计学意义(P<0.05)。和OVX组比较,阿魏酸组BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8表达水平上调,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论阿魏酸可以通过BMP2/Smads信号通路抑制去卵巢大鼠的骨量流失。

骨形态发生拮抗蛋白1参与调控脂毒性介导的胰岛β细胞功能障碍

目的探索骨形态发生拮抗蛋白1(Gremlin-1)在脂毒性介导的胰岛β细胞功能障碍中的作用和机制。方法利用棕榈酸(palmitic acid, PA)处理小鼠胰岛β细胞(MIN6)作为脂毒性介导胰岛β细胞功能障碍模型, 首先考察PA引起的脂质沉积及胰岛素分泌水平改变, 明确脂毒性对胰岛β细胞的影响, 进一步利用qPCR、Western blot等方法考察PA对Gremlin-1表达及其下游信号通路BMP4/Smads的影响。随后利用重组小鼠Gremlin-1和BMP信号通路抑制剂LDN193189干预细胞, 并与对照组进行比较。结果 PA刺激能够降低胰岛β细胞活力及胰岛素分泌能力(P<0.05)。同时, PA能够抑制细胞Gremlin-1的表达和分泌, 增加BMP-4及其下游Smad-1、Smad-5的表达(P<0.05)。利用重组小鼠Gremlin-1蛋白干预细胞可使细胞的胰岛素分泌显著升高, 同时BMP4/Smads信号通路中的关键分子表达降低(P<0.05)。而抑制BMP4/Smads信号通路可改善PA导致的胰岛β细胞功能障碍。结论 Gremlin-1参与调控脂毒性介导的胰岛β细胞功能障碍, 该作用可能与BMP4/Smads信号通路激活有关。