瑞马唑仑调节HIF-1α/BNIP3信号通路对OGD/R诱导神经细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨瑞马唑仑对OGD/R诱导的神经细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法体外培养小鼠海马神经元细胞(HT22)并进行神经细胞氧糖剥夺/再复氧(OGD/R),筛选实验用瑞马唑仑浓度;将HT22细胞分为对照组、OGD/R组、瑞马唑仑组、2-ME2组、瑞马唑仑+2-ME2组;CCK8法检测5组HT22细胞活力;流式细胞术检测5组HT22细胞凋亡率;透射电子显微镜观察5组HT22细胞自噬小体的形成;Western blot检测5组HT22细胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达。结果确定实验用瑞马唑仑浓度为50μg/mL;与对照组比较,OGD/R组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与OGD/R组比较,瑞马唑仑组HT22细胞自噬小体增加,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05);2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05)。与瑞马唑仑组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞自噬小体数量减少,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与2-ME2组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05)。结论瑞马唑仑可通过激活HIF-1α/BNIP3信号通路促进OGD/R诱导的神经细胞自噬,抑制细胞凋亡,从而减轻OGD/R诱导的神经细胞损伤。

中风活心软胶囊通过靶向微小RNA-126诱导缺氧诱导因子-1α/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制研究

目的探讨中风活心软胶囊通过靶向微小RNA(miRNA)-126诱导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制。方法选取30只无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠,随机分为空白组、模型组与治疗组,每组10只。采用Zea Longa法建立右侧大脑中动脉缺血(MCAO)大鼠模型。治疗组给予中风活心软胶囊。采用改良神经功能损害评分(mNSS)评估大鼠神经功能缺损情况,透射电镜观察缺血半暗区皮质神经元及自噬囊泡超微结构,蛋白质免疫印迹(WB)法和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法分别检测缺血半暗区皮质雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、HIF-1α蛋白及其mRNA和miR-126的表达水平。结果模型组、治疗组mNSS评分均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α蛋白表达水平均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1αmRNA表达水平均高于对照组,miR-126表达水平低于对照组,但治疗组mTOR、HIF-1αmRNA表达水平低于模型组,miR-126表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组缺血半暗区皮质神经元及电镜下自噬囊泡数量明显增加,细胞结构损坏减轻。结论中风活心软胶囊可显著提高脑缺血大鼠缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α因子表达,其作用机制可能是通过激活miR-126表达进而靶向调控mTOR/HIF-1α信号通路,促进自噬,从而发挥其脑保护效应。

柴胡皂苷调节HIF-1α/BNIP3信号通路抑制线粒体自噬治疗肝胃不和型功能性消化不良大鼠

目的探究柴胡皂苷调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)信号通路对肝胃不和型功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)大鼠胃窦组织线粒体自噬的影响。方法采用复合因素法构建肝胃不和型FD大鼠模型,随机分为空白组、模型组、吗丁啉组、柴胡皂苷低、中、高剂量组,其中吗丁啉组以2.7 mg·kg^(-1)吗丁啉灌胃,柴胡皂苷低、中、高剂量组分别腹腔注射2、4、8 mg·kg^(-1)柴胡皂苷,模型组和空白组给予相同剂量生理盐水灌胃和腹腔注射,连续干预7 d。观察各组大鼠胃肠功能:胃排空率、小肠推进率,ELISA法检测血清胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)含量,HE染色观察胃窦组织病理变化,透射电镜观察胃窦组织线粒体结构,试剂盒检测ROS、MDA、SOD水平,Western blot检测胃窦组织线粒体LC3、Beclin1、p62、HIF-1α、BNIP3蛋白表达。结果与空白组相比,模型组大鼠胃窦组织少量炎性细胞浸润,线粒体肿胀、变形,出现大量自噬体,胃排空率、小肠推进率、MTL、GAS、SOD、P62降低,ROS、MDA水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、HIF-1α、BNIP3蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,吗丁啉组和柴胡皂苷低、中、高剂量组胃窦组织症状明显改善,线粒体嵴清晰,自噬体减少,胃排空率、小肠推进率、MTL、GAS、SOD、p62升高,ROS、MDA水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、HIF-1α、BNIP3蛋白表达降低(P<0.05)。结论柴胡皂苷能够改善肝胃不和型FD大鼠肠胃功能,抑制线粒体自噬,其作用机制可能与抑制HIF-1α/BNIP3信号通路有关。

转染nm23-H_1基因靶向阻断人大细胞肺癌细胞株L9981 Wnt信号传导通路

目的 探讨nm2 3 H1 基因转染靶向阻断人高转移大细胞肺癌细胞株L9981Wnt信号传导通路的可行性 ,为阐明nm2 3 H1 基因调控肺癌转移抑制的分子机制和靶向治疗提供实验依据。方法 以转染nm 2 3 H1 基因的L9981 nm 2 3 H1 、原代L9981、空载L9981 pLXSN三株人高转移大细胞肺癌细胞为研究对象 ,应用Westernblot检测比较各株肺癌细胞胞浆、胞核中Wnt信号传导通路关键激酶GSK 3 β和 β 连环蛋白表达的变化。结果 ①GSK 3 β在L9981 nm 2 3 H1 肺癌细胞胞浆中表达量IOD( 63 41± 5 41)显著高于L9981( 373 6± 2 98)和L9981 pLXSN( 3 613± 3 83 ) (P <0 .0 0 1) ;②GSK 3 β在L9981 nm2 3 H1 肺癌细胞胞核中表达量IOD( 4 3 5 6± 490 )显著高于L9981( 65 7± 5 7)和L9981 pLXSN ( 70 5± 75 ) (P <0 .0 0 1) ;③β 连环蛋白在L9981 nm 2 3 H1 肺癌细胞胞浆中表达量IOD( 3 64 9± 118)显著高于L9981( 14 0 1± 3 1)和L9981 pLXSN ( 13 5 0± 5 5 )(P <0 .0 0 1) ;④β 连环蛋白在L9981 nm 2 3 H1 肺癌细胞胞核中表达量IOD( 2 945± 68)与L9981( 2 60 4± 2 3 )和L9981 pLXSN( 2 65 2± 5 3 )比较无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;⑤L9981与L9981 pLXSN两者间GSK 3 β和β 连环蛋白在肺癌细胞胞浆和胞核的?

BNIP3L/NIX介导线粒体自噬对缺血性脑卒中作用的研究进展

脑卒中是一种中老年多发的,具有致残率和死亡率的常见病[1]。脑卒中分为缺血性(ischemic stroke)和出血性(hemorrhagic stroke)两种类型,缺血性脑卒中约占87%[2]。缺血性脑卒中的发生机制十分复杂,涉及兴奋性氨基酸毒性、钙离子超载、炎症反应、细胞凋亡、线粒体功能障碍等,且这些因素相互影响相互联系,形成恶性循环,最终造成不可逆性脑损伤[3]。研究发现,大脑产生的ATP大部分用于神经元生电活动[4]。因此,线粒体提供足够的能量对神经元的兴奋性和存活至关重要。除了产生能量外,线粒体和NADPH氧化酶,是活性氧(reactive oxygen species,ROS)的主要来源,并作为细胞凋亡调节剂[5]。越来越多的证据表明,在各种神经系统疾病中,ROS过量产生与神经元死亡之间存在密切关系,这与脑缺血的发病机制也密切相关[6]。因此,线粒体功能障碍是缺血性脑卒中发展的重要环节,线粒体功能障碍引起的线粒体自噬与缺血性脑卒中是密不可分的。

基于PI3K/Akt信号通路探讨“赤芍-附片”对肝细胞炎症损伤的影响

目的基于磷脂酰激醇3激酶(phosphati-dylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB又称Akt)信号通路,探讨“赤芍-附片”对肝细胞炎症损伤的保护作用。方法体外培育L02细胞株,设立正常组、模型组、空白血浆组、“赤芍-附片”组、Copanlisib(PI3K抑制剂)组,采用D-半乳糖联合脂多糖干预构建肝细胞炎症损伤模型。通过CCK-8法筛选含药血浆最佳干预浓度及时间;透射电镜观察细胞超微结构;ELISA法检测白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达水平;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-q PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)测定PI3K/Akt通路m RNA及蛋白表达水平。结果较之正常组,模型组受损细胞器及自噬体数量增加,IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高(P<0.01),PI3K、Akt mRNA及磷酸化蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。较之模型组,“赤芍-附片”组细胞形态相对正常且自噬体数量减少,IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著下降(P<0.01),PI3K、Akt mRNA及磷酸化蛋白表达上调(P<0.01或P<0.05)。结论“赤芍-附片”药对可能通过调控PI3K/Akt信号通路,减少IL-1β、IL-6、TNF-α分泌,从而减轻D-半乳糖联合脂多糖诱导的肝细胞损伤。

nesfatin-1在胰岛素抵抗骨骼肌细胞中对PI3K/AKT信号通路的影响

目的探讨过表达新型饱食分子蛋白(nesfatin-1)对L6骨骼肌胰岛素抵抗及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路和下游糖原合成酶激酶(GSK)-3β、葡萄糖转运蛋白(GLUT)-4表达的影响。方法建立L6细胞胰岛素抵抗模型后,用过表达nesfatin-1的腺相关病毒(AAV)和空载对照腺相关病毒(PC)感染L6细胞,将细胞分为四组,分别为空载对照腺相关病毒组(PC组),PC+棕榈酸(PA)组,过表达nesfatin-1组,nesfatin-1+PA组,四组均加入100 nmol/L重组人胰岛素(Insulin),PC+PA组和nesfatin-1+PA组再加入250μmol/L PA处理24 h后收集培养基上清,用葡萄糖过氧化物酶方法测定上清液中葡萄糖含量,用Western印迹检测PI3K、AKT及其下游信号分子GSK-3β、GLUT-4的蛋白表达变化。结果与PC组比较,过表达nesfatin-1组p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表达水平明显增高(P<0.05);与PC+PA组相比,nesfatin-1+PA组p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表达水平明显增高(P<0.05);与nesfatin-1组相比,nesfatin-1+PA组p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论过表达nesfatin-1可显著增加骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取,减轻胰岛素抵抗,并经PI3K-AKT通路上调下游GSK-3β、GLUT-4的表达。

nm23-H_1基因点突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981的GSK-3β激酶活性的影响

背景与目的我们的前期研究结果表明nm23-H1基因的肺癌转移抑制作用可能与上调Wnt信号通路中关键激酶GSK-3β的活性、进而抑制Wnt信号通路相关。本研究的目的是探讨nm23-H1点突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中胞质和胞核的GSK-3β激酶活性的影响,为阐明nm23-H1基因调控肺癌转移相关信号传导通路的分子机制提供实验依据。方法将原代人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980、原代人高转移大细胞肺癌细胞株L9981、空载体转染细胞株L9981-pEGFP、稳定转染nm23-H1基因的细胞株L9981-nm23-H1-pEGFP以及稳定转染在44、96、118、120号位点发生突变后的nm23-H1基因的转基因肺癌细胞株L9981-nm23-H1S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP、L9981-nm23-H1H118F-pEGFP和L9981-nm23-H1S120G-pEGFP作为研究对象,应用免疫共沉淀同位素闪烁计数法测定上述肺癌细胞株胞质和胞核中的GSK-3β激酶活性。结果nm23-H1基因发生点突变后,所有转基因肺癌细胞株细胞胞质和胞核中的GSK-3β活性均较突变前有所下降。L9981-nm23-H1S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP、L9981-nm23-H1H118F-pEGFP、L9981-nm23-H1S120G-pEGFP分别与L9981-nm23-H1-pEGFP比较,胞质与胞核中GSK-3β激酶活性均存在显著性差异(P<0.05),其中L9981-nm23-H1P96S-pEGFP与L9981-nm23-H1-pEGFP胞质中GSK-3β活性存在极显著差异(P<0.01),L9981-nm23-H1S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP和L9981-nm23-H1H118F-pEGFP与L9981-nm23-H1-pEGFP的胞核中GSK-3β活性存在极显著差异(P<0.01)。结论①nm23-H1基因突变能显著影响其对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981胞质和胞核中GSK-3β激酶活性的调控作用;②nm23-H1基因可能通过调控L9981中GSK-3β激酶活性来抑制L9981细胞株中Wnt信号传导。

EDDE联合依折麦布对高脂血症合并WSI患者血脂、炎症/神经通路及脑细胞凋亡因子的影响

目的探究依达拉奉右莰醇(EDDE)联合依折麦布在高脂血症合并分水岭脑梗死(WSI)患者治疗中的潜在机制。方法选取2021年3月至2023年12月郑州市第二人民医院收治的80例高脂血症合并WSI患者纳入研究,按随机数表法分为研究组和对照组各40例,对照组患者在常规治疗的基础上采用依折麦布治疗,研究组在对照组治疗的基础上联合EDDE治疗,连续治疗14 d。治疗后比较两组患者的临床疗效,以及治疗前后的血脂水平[高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]、CD40/CD40L炎症信号通路[白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、可溶性CD40配体(sCD40L)]、磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/苏氨酸蛋白激酶(AKT)神经信号通路、脑细胞凋亡因子[抗凋亡因子(Livin)、可溶性凋亡相关因子(sFas)、sFas配体(sFasL)]、功能恢复情况[神经功能缺损(NIHSS)、认知功能(MMSE)]。结果研究组患者的治疗总有效率为92.50%,明显高于对照组的75.00%,差异有统计学意义(P<0.05);治疗14 d后,研究组患者TC、TG、LDL-C明显低于对照组,HDL-C高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗14 d后,研究组患者IL-1、IL-6、sCD40水平分别为(8.12±1.25)pg/mL、(1.53±0.34)pg/mL、(185.29±45.32)pg/mL,明显低于对照组的(13.78±1.64)pg/mL、(2.55±0.40)pg/mL、(289.18±52.25)pg/mL,IL-10水平为(49.10±4.28)pg/mL,明显高于对照组的(37.75±5.44)pg/mL,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗14 d后,研究组患者PMBC内的PI3K、AKT、mTOR蛋白表达分别为1.34±0.23、1.25±0.26、1.57±0.35,明显高于对照组的1.10±0.19、1.11±0.21、1.23±0.24,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗14 d后,研究组患者的血清sFasL、sFas水平分别为(2.42±0.41)ng/mL、(3.65±0.47)ng/mL,明显低于对照组的(4.26±0.58)ng/mL、(6.04±0.59)ng/mL,Livin水平为(9.57±1.18)μmol/L,明显高于对照组的(7.42±1.05)μmol/L,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗14 d后,研究组患者的NIHSS评分(7.46±1.62)分,明显低于对照组的(10.85±2.26)分,MMSE评分(21.32±3.14)分,明显高于对照组的(17.49±2.57)分,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论EDDE联合依折麦布治疗高脂血症合并WSI能调控患者的CD40/CD40L炎症信号通路、PI3K/Akt神经信号通路及神经凋亡相关分子表达,促进患者认知功能和神经功能恢复,与单纯依折麦布治疗相比,联合EDDE治疗效果更好。

L型氨基酸转运蛋白抑制剂BCH联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用

目的:探讨L型氨基酸转运蛋白抑制剂2-氨基双环-(2,2,1)-庚烷-2-羧酸(BCH)单用及联用顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞生长的影响及其可能的分子机制。方法:人卵巢癌SKOV3细胞经不同浓度的BCH及BCH联合顺铂处理后,采用CCK-8法检测各组细胞的增殖活性;Western blot检测BCH对mTOR通路的影响。结果:单用BCH可显著抑制SKOV3细胞增殖,并呈现一定的时间-剂量依赖性。联用顺铂较之单独用药组,细胞活性明显降低(P<0.01),且BCH在顺铂之后应用时抑制作用更为明显(P<0.05)。Western blot显示BCH可抑制mTOR、p70 S6K和4E-BP1磷酸化,阻断mTOR通路。结论:L型氨基酸转运蛋白抑制剂BCH单用及联用顺铂均可显著抑制人卵巢癌SK-OV3细胞增殖,且BCH在顺铂之后应用抑制作用更明显,呈协同作用。

基于HIF-1α/BNIP3信号通路调控线粒体自噬探讨通脉开窍丸治疗血管性痴呆大鼠的机制

目的:观察通脉开窍丸对血管性痴呆(VD)大鼠海马体缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(BNIP3)信号通路及线粒体自噬的影响。方法:将90只雄性SD大鼠适应性喂养1周后,随机抽选10只作为假手术组,仅分离颈总动脉不结扎,剩余大鼠将采用颈总动脉分次结扎法制作VD大鼠模型。剔除死亡和造模不成功的大鼠后,将造模成功的大鼠随机分为模型组、通脉开窍丸高、中、低剂量组(27.6、13.8、6.9 g·kg^(-1))、盐酸多奈哌齐组(0.45 mg·kg^(-1))、联合组(通脉开窍丸高剂量27.6 g·kg^(-1)+HIF-1α抑制剂YC-12.5 mg·kg^(-1)),各组对应治疗4周后取材。尼氏染色法观察海马区神经元丢失情况;苏木素-伊红(HE)染色观察海马区病理学变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马组织HIF-1α、BNIP3、自噬效应蛋白-1(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)蛋白表达水平;透射电镜观察海马组织线粒体超微结构及自噬小体数量;免疫荧光(IF)观察海马组织HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度。结果:与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期延长(P<0.01),穿越平台次数减少(P<0.01),海马区神经元层次减少,数量骤减,结构排列不齐,尼氏小体数量减少,丢失严重,线粒体嵴紊乱,线粒体双模结构破坏,损伤加重,自噬小体数量增加,HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3B蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度增强(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,通脉开窍丸各治疗组、盐酸多奈哌齐组大鼠寻找平台时间缩短(P<0.01),穿越平台次数增加(P<0.01),HE染色显示,海马神经元细胞数量增多,形态正常,排列整齐,尼氏小体丰富,丢失减少,损伤减轻,自噬小体数量增多,HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3B蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度增强(P<0.05,P<0.01)。与通脉开窍丸高剂量组比较,联合组大鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.01),穿越平台次数显著降低(P<0.01),海马神经元细胞数量减少,损伤加重,尼氏小体数量下降,自噬小体数量有所减少,HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3B蛋白表达显著降低(P<0.01),HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度显著下降(P<0.01)。结论:通脉开窍丸可能通过激活HIF-1α/BNIP3信号通路,促进线粒体自噬的发生,清除功能受损的线粒体,为健康细胞提供能量,减少神经细胞死亡,促进脑功能的恢复,从而减轻大鼠海马组织的缺血性损伤,提高大鼠学习记忆能力,从而发挥对VD的治疗作用。

PARP9-DTX3L通过宿主组蛋白H2BJ抑制病毒3C蛋白酶从而增强干扰素效应并抵抗病毒感染

干扰素信号转导通路的激活及下游干扰素诱导基因（interferon-stimulated genes,ISGs）的表达是天然免疫系统的重要组成部分。提高细胞对干扰素的反应可增强宿主对病原体的抵抗能力。信号转导与转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1,STAT1）作为干扰素信号通路中一个关键的转录因子,可以激活细胞表达ISGs,产生多种抗病毒蛋白。

补青颗粒对高糖诱导人晶状体上皮细胞线粒体自噬Bnip3/Nix信号通路的影响

目的:观察补青颗粒对高糖诱导人晶状体上皮细胞(HLE)线粒体自噬Binp3/Nix信号通路的影响。方法:体外培养HLE细胞,空白组HLE细胞于正常培养液中培养48h,模型组在空白组培养液中加30mmol/L葡萄糖,实验组在模型组基础上加入不同含药血清培养48h。CCK-8法检测不同含药血清对高糖诱导HLE细胞增殖活力的影响;RT-PCR法检测各组细胞LC3-Ⅱ和LC3-ⅠmRNA表达;Western Blot检测各组细胞Bnip3、Nix的表达。结果:模型组HLE增殖活力较空白组增强(P<0.01),杞菊与补青颗粒各浓度组HLE增殖活力较模型组均降低(P<0.01),且各给药组间比较,以补青中浓度组细胞降低明显(P<0.01);各组HLE细胞均可见LC3-Ⅱ与LC3-ⅠmRNA表达,LC3-Ⅱ/Ⅰ呈先增后减趋势,并于损伤后24h时达高峰,且以补青颗粒中浓度组更显著(P<0.01);模型组各时间点Bnip3、Nix表达较空白组增高(P<0.01,P<0.05),杞菊和补青颗粒中浓度组Bnip3、Nix表达较模型组增高(P<0.01,P<0.05),且补青颗粒中浓度组较杞菊组增高(P<0.01,P<0.05)。同组别不同时间点比较,模型组、杞菊组、补青颗粒中浓度组Bnip3、Nix表达量均呈先增后减趋势,并于24h时达高峰(P<0.01,P<0.05)。结论:补青颗粒对高糖诱导的HLE细胞线粒体自噬相关蛋白的表达有显著影响,线粒体自噬的改变可能是补青颗粒改善白内障发病的机制之一。

OX40L对变应性鼻炎大鼠PI3K/Akt信号通路及T细胞亚群的影响

目的观察OX40L对变应性鼻炎(AR)大鼠PI3K/Akt信号通路相关蛋白及T细胞亚群的影响。方法将40只SPF级SD大鼠随机分为4组,各10只,各组采用既定方式造模,造模完成后对照组和模型组给予生理盐水鼻黏膜内注射干预,抗OX40L组给予抗OX40L单克隆抗体鼻黏膜内注射干预,OX40L-Ig组给予OX40L-Ig融合蛋白鼻黏膜内注射干预。造模完成后测定各组大鼠外周血OX40L表达,干预结束后观察PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达,检测T细胞亚群Th1、Th2、Th17、Treg细胞数量。结果模型组、抗OX40L组和OX40L-Ig组造模后未干预大鼠OX40L表达水平明显高于对照组(P<0.01)。模型组、抗OX40L组和OX40L-Ig组均可见杯状细胞化生、炎性细胞浸润、水肿、血管扩张等表现。对照组、抗OX40L组大鼠鼻黏膜组织p-PI3K、p-Akt表达明显低于模型组(P<0.05),抗OX40L组上述指标水平低于OX40L-Ig组(P<0.05),OX40L-Ig组上述指标水平高于模型组(P<0.05)。模型组血清Th1、Treg含量明显低于对照组(P<0.05),Th2、Th17含量明显高于对照组(P<0.05);抗OX40L组血清Th1、Treg含量明显高于模型组(P<0.05),Th2、Th17含量明显低于模型组(P<0.05);OX40L-Ig组血清Th1、Treg含量低于模型组(P<0.05),Th2、Th17含量高于模型组(P<0.05)。结论AR大鼠OX40L表达水平明显异常,可能参与PI3K/Akt信号通路中PI3K、Akt蛋白磷酸化的调控,影响Th2、Th17细胞分化,加重AR病理变化,抗OX40L单克隆抗体可降低PI3K、Akt蛋白磷酸化水平,纠正Th1、Th2、Th17、Treg细胞含量异常状态,有望成为治疗AR的新方法。

高稳定性L02细胞胰岛素抵抗模型的建立及其分子机制

为确定建立胰岛素抵抗L02细胞(IR-L02)模型的最佳条件并探究IR-L02发生机制,采用葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)检测细胞的葡萄糖消耗量,确定建立IR-L02最佳条件,考察其稳定性;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胰岛素受体底物/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(IRS/PI3K/AKT)信号通路关键蛋白及葡萄糖转运蛋白(glucose transporters,GLUTs)表达变化。结果表明:胰岛素浓度1×10^(-8)mol·L^(-1)、葡萄糖浓度40 mmol·L^(-1)、干预L02细胞48 h时细胞葡萄糖消耗量最低,此条件为建立L02细胞胰岛素抵抗模型最佳条件,该模型在72 h内保持稳定,且IR-L02细胞内糖原含量显著降低。L02细胞胰岛素抵抗形成的机制为抑制IRS/PI3K/AKT信号通路及GLUTs。

OX40L对儿童哮喘和哮喘小鼠模型辅助性T细胞分化的影响

目的:探讨OX40L对哮喘细胞免疫过程中辅助性T细胞分化的影响。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测哮喘患者和健康受试者血清OX40L、IL-4、IL-17、IFN-γ和TGF-β的浓度。3H-TdR渗入法测定T细胞的增殖。流式细胞仪分析Th1、Th2、Th17和Treg细胞数量。Western blot检测蛋白质表达和磷酸化。苏木精和伊红(HE)染色评价肺组织病理改变。结果:与稳定期哮喘患者或健康对照受试者相比,急性期哮喘患者的OX40L、IL-4和IL-17水平明显增加,而IFN-γ和TGF-β水平明显降低。用OX40L-Ig融合蛋白处理时,CD4^+T细胞的增殖进一步增加。OVA诱导的CD4^+T细胞中Akt的磷酸化水平升高,而OX40L-Ig融合蛋白处理的细胞中Akt的磷酸化水平进一步升高。PI3K/Akt抑制剂LY294002处理明显降低了OVA诱导的CD4^+T细胞的增殖。LY294002处理后,OVA诱导的CD4^+T细胞中IL-4、IL-17以及Th2和Th17细胞的数量明显减少。相反,LY294002显著升高了IFN-γ和TGF-β的表达以及Th1和Treg细胞的数量。用抗小鼠OX40L单抗处理时,与OX40L-Ig融合蛋白处理组相比,IL-4和IL-17水平以及Th2和Th17细胞的数量显著减少,而IFN-γ和TGF-β水平以及Th1和Treg的数量明显增加。HE染色显示,用抗小鼠OX40L单抗处理可抑制哮喘小鼠肺组织病变。结论:OX40L通过PI3K/Akt信号通路诱导了Th2和Th17细胞的分化,用抗小鼠OX40L单抗阻断OX40L可以诱导哮喘中的Th1和Treg细胞分化。

基于自噬途径的脐带间充质干细胞促进糖尿病模型创面愈合的作用机制

目的旨在从自噬途径HIF-1α/BNIP3/Beclin-1的角度,探讨脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对糖尿病大鼠创面愈合的促进作用及潜在机制。方法将大鼠随机数字表法分为空白组、模型组、MSC组、MSC^(HIF-1α)组和自噬抑制剂组(CQ组)。采用高脂喂养联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射诱导2型糖尿病模型。在大鼠背部做全层皮肤切除创伤以构建皮肤创面损伤模型。于创伤后计算创面愈合率。采用苏木精染色观察创面皮肤组织结构,采用Masson染色观察创面皮肤组织中胶原纤维沉积情况。采用免疫组织化学染色观察创面毛细血管新生情况。采用透射电镜观察创面组织细胞的自噬状态及超微结构。采用蛋白免疫印迹分析创面组织中HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3蛋白的表达水平。结果与空白组相比,模型组创面愈合率、创面组织CD31阳性染色细胞比例,以及HIF-1α、BNIP3、Beclin-1蛋白表达以及LC3II/LC3I水平均明显减少(P<0.05),而创面完全愈合时间和瘢痕厚度均明显增加(P<0.05);与模型组相比,MSC组创面愈合率、创面组织CD31阳性染色细胞比例,以及HIF-1α、BNIP3、Beclin-1蛋白表达以及LC3II/LC3I水平明显增加(P<0.05),而创面完全愈合时间和瘢痕厚度均明显增加减少(P<0.05);与MSC组相比,MSC^(HIF-1α)组创面愈合率、CD31阳性染色细胞比例,以及HIF-1α、BNIP3、Beclin-1蛋白表达以及LC3II/LC3I水平均明显增加(P<0.05),而创面完全愈合时间和瘢痕厚度均明显减少(P<0.05);与MSC^(HIF-1α)组相比,CQ组创面愈合率、创面组织CD31阳性染色细胞比例,以及HIF-1α、BNIP3、Beclin-1蛋白表达以及LC3II/LC3I水平均明显降低(P<0.05),而创面完全愈合时间和瘢痕厚度均明显增加(P<0.05)。结论hUC-MSCs能够改善糖尿病大鼠创面组织损伤,促进肉芽组织生长和血管生成,加速创面愈合,其机制可能是通过调控HIF-1α/BNIP3/Beclin-1信号通路介导的自噬激活来实现。

二氯化钴诱导缺氧对肌细胞萎缩的调控机制研究

目的:探讨二氯化钴(cobaltous chloride,Co Cl2)诱导缺氧对肌细胞萎缩的调控机制。方法:本研究采用C2C12小鼠成肌细胞系作为细胞模型,分为正常组、Co Cl2组、正常+3-Methyladenine(3MA)组、Co Cl2+3MA组。正常组不作处理,Co Cl2组加入200μM Co Cl2诱导缺氧,正常+3MA组加入5 m M 3MA,Co Cl2+3MA组加入200μM Co Cl2及5 m M 3MA。使用吉姆萨染色观察肌管形态,多功能酶标仪检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)表达,电镜观察自噬体形成情况,实时定量聚合酶链反应(quantita-tive real time polymerase chain reaction,QRT-PCR)和免疫印迹技术(western blotting,WB)检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、Bcl2/腺病毒E1B 19k Da相关蛋白3(Bcl2/adenovirusE1B 19k Da interacting protein 3,BNIP3)、微管相关蛋白1轻链-3(microtubule associated protein1 lightchain 3,LC3)m RNA及蛋白表达;另外,通过抑制自噬观察肌肉萎缩盒F基因(muscle atrophy F-box,MAFbx)蛋白表达的变化。结果:正常组可见长条状肌管形成,Co Cl2处理后肌管萎缩、断裂。Co Cl2组ROS含量较正常组升高(t=-4.965,P=0.008),电镜可观察到Co Cl2诱导自噬体形成,同时HIF-1α、BNIP3、LC3表达增加(P<0.05)。Co Cl2与3MA共处理可减少MAFbx蛋白的表达(F=18.246,P=0.001)。结论:Co Cl2诱导C2C12骨骼肌细胞萎缩,可能与HIF-1α/BNIP3信号通路促进自噬发生有关,抑制缺氧诱导的自噬可部分减少肌萎缩。

大黄黄连泻心汤加味对肥胖2型糖尿病大鼠内脏脂肪线粒体自噬及棕色化影响

目的:观察大黄黄连泻心汤加味对肥胖2型糖尿病(T2DM)模型ZDF大鼠内脏脂肪组织线粒体自噬及棕色化的影响。方法:将40只ZDF大鼠高脂饲料诱导为肥胖T2DM模型,随机分为模型组、二甲双胍组(0.18 g·kg^(-1))、大黄黄连泻心汤加味高、中、低剂量组(2.16、1.08、0.54 g·kg^(-1)),每组8只,另取8只ZDF(fa/+)大鼠作为正常组,灌胃体积均为10 mL·kg^(-1),模型组和正常组灌服等体积纯净水,1次/d,持续12周。定期检测大鼠空腹血糖(FBG);干预12周后检测大鼠体质量、附睾脂肪质量、血清中葡萄糖(GLU)、糖化血清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;采用苏木素-伊红(HE)染色观察附睾脂肪组织病理形态学改变;透射电镜(TEM)观察脂肪细胞线粒体自噬情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测附睾脂肪低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(BNIP3)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、泛素结合蛋白1(p62)、解偶联蛋白1(UCP1)、碘代甲状腺素2(Dio2)、PR结构域结合因子16(Prdm16)mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测附睾脂肪HIF-1α、BNIP3、LC3B、p62及UCP1蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠附睾脂肪出现病理学改变;脂肪细胞线粒体固缩、自噬小体较多并发生线粒体自噬;大鼠体质量、附睾脂肪质量、FBG、GLU、GSP、TC、TG、LDL-C水平显著升高(P<0.01),HDL-C水平显著降低(P<0.01),附睾脂肪HIF-1α、BNIP3、LC3B mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01),p62、UCP1 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01),Dio2、Prdm16 mRNA表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠附睾脂肪组织病变不同程度减轻;二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高剂量组大鼠脂肪细胞胞浆中线粒体形态结构完整,嵴清晰,基质均匀,胞浆中可见少量自噬溶酶体和自噬小体;二甲双胍组、大黄黄连泻心汤加味高、中剂量组大鼠体质量及附睾脂肪质量均显著降低(P<0.01);各给药组大鼠附睾脂肪指数均明显降低(P<0.05);各给药组大鼠FBG均显著降低(P<0.01);二甲双胍组及大黄黄连泻心汤加味高、中剂量组大鼠血清中GSP、GLU、TG、LDL-C水平均明显降低(P<0.05,P<0.01);二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高剂量组大鼠血清TC水平显著降低(P<0.01),各给药组大鼠血清HDL-C水平均明显升高(P<0.05,P<0.01);二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高、中剂量组附睾脂肪HIF-1α、BNIP3、LC3B mRNA及蛋白表达明显降低,UCP1蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高剂量组p62、Dio2、Prdm16 mRNA及p62蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:大黄黄连泻心汤加味可能通过HIF-1α/BNIP3/LC3B途径抑制内脏脂肪组织线粒体自噬,促进脂肪棕色化,改善肥胖T2DM糖脂代谢。