PCR-RFLP检测安庆六白猪BPI基因第10外显子的多态性

为探讨安庆六白猪杀菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability increasing protein)即BPI基因的遗传多态性,本研究通过PCR-RFLP方法,检测了BPI基因第10外显子在安庆六白猪上的多态性。结果表明,在安庆六白猪中,GT基因型为优势基因型,T等位基因是优势等位基因;推测安庆六白猪BPI基因的GT基因型可能具有较高的免疫力,为安庆六白猪的保种和选育提供了有益的资料。

仔猪BPI基因表达水平与大肠杆菌F18菌株感染的关系

文章利用已建立的苏太猪F18大肠杆菌病抗性和敏感性资源家系群体作为实验材料,分别选择8头35日龄左右生长性状基本一致的大肠杆菌F18菌株抗性和敏感性断奶仔猪,运用Real-time PCR方法检测BPI基因mRNA在断奶仔猪各个组织的分布情况,并比较其在大肠杆菌F18菌株抗性型和敏感型断奶仔猪个体间的差异表达水平,为探讨该基因在免疫和抗大肠杆菌F18菌株感染中的作用提供依据。结果表明,在对所有个体检测的11个组织中,BPI基因在心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴结中几乎不表达,或表达量很低,但在十二指肠和空肠中表达量很高。在十二指肠和空肠中,BPI基因在抗性组的表达量均显著高于敏感组的表达量(P<0.05)。由此表明,BPI基因对抗断奶仔猪肠道中大肠杆菌F18菌株的感染可能具有直接作用,并且个体对大肠杆菌F18菌株的抗性可能与BPI基因在肠道中表达量上调有关。

猪BPI基因部分cSNPs检测及其对蛋白结构功能的影响

本试验以98头苏太猪为研究对象,检测BPI基因部分编码区的单核苷酸多态性(SNPs),并预测分析碱基突变对BPI蛋白结构和功能的影响。利用PCR-SSCP和PCR-RFLP结合测序的方法检测BPI基因外显子1、4和10的SNPs,运用生物信息学比较分析原蛋白和突变型蛋白的理化性质和结构。结果表明,以BPI基因cDNA序列作为参照,BPI外显子1、4和10存在6个SNPs,3个同义突变(c.24A>G、c.54T>C和c.522C>T)和3个错义突变(c.433C>T(Arg145Trp)、c.1060A>G(Thr354Ala)和c.1151T>G(Leu384Arg))。3种错义突变未改变BPI蛋白的理化性质、信号肽、跨膜区、糖基化位点以及二、三级结构,但是导致磷酸化位点的改变或存在其他潜在功能位点区域。Western blot试验发现,BPI蛋白的分子量为53ku,苏太猪F18大肠杆菌抗性型猪的BPI蛋白表达量显著高于敏感型猪。猪BPI外显子4和10的碱基突变不同程度影响到蛋白功能,并可能对机体疾病的抗性/易感性产生影响。

13个物种BPI基因编码区生物信息学分析

本研究采用生物信息学的方法比较不同物种BPI基因编码区CDS序列,分析人、小家鼠、褐家鼠、牛、白颊长臂猿、原鸡、家兔、野猪、猕猴、家马、非洲爪蟾、毛猩猩、犬13个物种BPI基因编码区的遗传多样性,且对BPI氨基酸序列组成、信号肽、疏水性/亲水性、跨膜结构、二级结构及保守结构域进行预测分析。结果表明,在13个物种的29条BPI基因CDS序列中,共检测到532个多态位点,生成了15种单倍型,BPI基因在种群间及种群内均存在较大的遗传变异,BPI基因具有较强的密码子偏爱性。BPI蛋白理论等电点均大于7,呈碱性,N端大都有信号肽,肽链表现为亲水性,基本属于跨膜蛋白和分泌蛋白。BPI蛋白主要二级结构元件为α螺旋、β折叠和无规则卷曲,有2个保守结构域BPI1和BPI2。

黔邵花猪BPI基因的cDNA克隆及蛋白质序列分析

从猪血液总RNA中克隆出BPI基因,对该基因的cDNA进行序列分析。结果表明:克隆到的序列全长1 874 bp(基因登录号为FJ810853),其中1 452 bp的开放阅读框编码483个氨基酸残基,含13.25%的亮氨酸,有一段27个氨基酸的信号肽序列。同源性分析结果显示:猪BPI与人、牛、兔、狗、大鼠、小鼠、鲤鱼、非洲爪蟾、大西洋鲑和大黄鱼BPI分子氨基酸序列的同源性分别为64%、74%、59%、67%、53%、51%、35%、44%、28%和27%。该蛋白氨基端部分和羧基端部分为2个明显不同的功能区,各存在1个超活性结构域,中间为胰蛋白酶水解位点,表现出类似人BPI结构的特征。

新疆巴什拜羊BPI基因cDNA全长的克隆及序列分析

【目的】克隆巴什拜羊杀菌/通透性增强蛋白(BPI)的cDNA序列,为研究该蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到中性粒细胞后提取RNA。根据GenBank中牛BPI基因的cDNA序列设计兼并引物,用RT-PCR方法扩增巴什拜羊BPI基因部分序列,再根据已知的巴什拜羊BPI基因部分序列设计RACE引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,分别回收克隆的目的基因片段,再与pMD18-T载体连接,分别转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后进行拼接,获得巴什拜羊BPI基因全长cDNA序列,并对序列进行分析。【结果】克隆的巴什拜羊BPI基因cDNA序列全长1 922bp,其中开放阅读框为1 452bp,共编码483个氨基酸;BLAST分析表明,巴什拜羊BPI基因的核苷酸序列与绵羊、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾核苷酸的一致性分别为99%,91%,78%,74%,64%,61%,58%,53%和50%;氨基酸进化分析显示,巴什拜羊首先与绵羊聚为一类,其次与牛聚为一类,该聚类分析结果与生物学分类结果表现一致。【结论】通过RACE方法成功地克隆了1 922bp的巴什拜羊BPI基因cDNA全长序列,且基因进化树聚类结果与生物学分类结果相一致。

日本鳗鲡抗菌蛋白BPI基因的克隆、鉴定与表达

为探究鱼类抗菌肽—杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)的功能,从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆和鉴定了两个BPI基因,命名为AJBPI-1和AJBPI-2。这两个抗菌肽均具有BPI超家族特征性的LPS结合结构域和脯氨酸富集区,其中AJBPI-1和AJBPI-2的N-端碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)的数量分别为12和35,表明前者对LPS的结合力较后者弱。Real-time PCR检测结果显示,AJBPI-1在正常养殖鳗鲡的肝脏中转录表达量最高,其次是头肾,而AJBPI-2则在中肾和头肾中转录表达量最高,其次是血液。Poly I:C和E.tarda诱导后,鳗鲡脾脏中AJBPI-1和AJBPI-2的表达量均显著上调(P<0.05),AJBPI-1约为PBS对照组的4.0倍和3.3倍,AJBPI-2为PBS对照组的2.3倍和1.7倍;经LPS、Poly I:C和E.tarda刺激后,鳃中AJBPI-2表达量显著上调(P<0.05),上调幅度最高可达到PBS组的2.5倍、17.0倍和7.0倍;而中肾只在LPS和Poly I:C刺激时,AJBPI-1和AJBPI-2的表达量显著上调(P<0.05),AJBPI-1约为PBS对照组的3.0倍和2.2倍,AJBPI-2为PBS对照组的2.0倍和2.2倍。

BPI基因在梅山猪初生断奶以及成年阶段的组织表达谱分析

为探讨杀菌/通透性增强蛋白(BPI)基因在梅山猪从初生到成年各个时期不同组织中的表达规律,利用qPCR检测初生、断奶、性成熟、体成熟4个重要发育时期(即1、35、134、158日龄)梅山猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠、空肠和回肠12个组织中BPI基因的表达水平。结果表明:4个不同发育阶段BPI基因的组织表达谱在心脏、肝脏、脾脏、肌肉和胸腺中均表现出相对一致的规律,即BPI基因的表达量一直处于极低水平,而在肠道组织中从初生到成年各时期均高度表达;BPI基因在胃中的表达程度随着日龄增长而显著提高;在小肠组织中,35日龄断奶仔猪BPI基因的表达水平极显著高于其他3个日龄。综上,推断肠道中BPI基因的高度表达是仔猪从初生就具有的抵抗大肠杆菌等病原感染属固有免疫的一部分,而在胃中的表达很可能是其后天为了抵御不断侵染的大肠杆菌等病原的结果。

BPI基因融合蛋白的研究进展

杀菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)基因是人和哺乳动物的内源性阳离子蛋白,对革兰阴性菌具有强力的杀菌作用和中和内毒素功能,在革兰氏阴性菌感染的治疗方面有良好的发展前景。但在应用上存在体内半衰期短、用药剂量大、生产成本高等问题,目前主要是通过BPI融合蛋白方式改良BPI基因蛋白,以更好的发挥BPI蛋白的作用。

猪BPI基因第10外显子遗传变异分析

猪BPI基因的多态性与动物的免疫力和抗病毒感染明显相关。本研究利用PCR-RFLP的方法对180头晋汾白猪和64头新山西黑猪的BPI基因第10外显子Hpa II酶切位点的遗传变异性进行了检测,检测到晋汾白猪和新山西黑猪分别有GG、TT、GT三种基因型,晋汾白猪基因型频率分别为0.0222、0.7389、0.2389,新山西黑猪基因型频率分别为0.0781、0.2188、0.7031。运用PopGene32软件进行群体遗传学分析,晋汾白猪和新山西黑猪BPI基因的香农指数分别为0.4080、0.6832,新山西黑猪在BPI基因Hpa II酶切位点极不符合哈代-温伯格平衡(p<0.01)。运用SAS8.1进行卡方检验,BPI基因的多态位点在晋汾白猪和新山西黑猪的基因型分布差异极显著(p<0.01)。通过对晋汾白猪和新山西黑猪BPI基因第10外显子的多态性分析为下一步的分子标记辅助选择提供基本依据。

斑点叉尾鲖BPI1基因的原核表达及生物信息学分析

为探究斑点叉尾鲖BPI1抗菌肽基因编码蛋白的结构特征,实验提取斑点叉尾鲖肾脏RNA,根据BPI1基因序列设计引物,利用PCR方法克隆BPI1基因并构建至原核表达载体p TWIN1中。构建成功的重组质粒p TWIN1-BPI1经原核表达,SDS-PAGE检测显示得到约为50 ku的融合蛋白,与预期结果相一致。通过生物信息学软件对BPI1基因编码的蛋白序列进行分析,结果显示,克隆所得斑点叉尾鲖BPI1基因编码一条由223个氨基酸残基组成的多肽,等电点为9.07,属于BPI超家族,是稳定的亲水蛋白。亚细胞定位BPI1分布在线粒体(43.5%)、细胞质(30.4%)和细胞核(26.1%)中,表明BPI1可能在嘌呤和嘧啶合成以及能量代谢等过程中发挥信号转导、促进生长等重要作用。二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,三级结构呈棒状。同源性及进化树分析表明,实验所得BPI1基因序列与斑点叉尾鲖BPI抗菌肽基因的同源性最高,序列一致性为99.1%,进化树聚为一支,表明BPI1基因编码的蛋白序列在相同物种中的突变率较低,保守性较高,相同物种中其生物活性与个体间的差异关系较小。

猪杀菌/通透性增加蛋白基因siRNA载体构建及干扰效果评价

本研究旨在构建并筛选猪(Sus scrofa)BPI基因的高效siRNA干扰载体,为在细胞水平上研究猪BPI基因的功能和作用机制提供基础。参照猪BPI基因(GenBank登录号:EF436278)全长编码区序列,设计其特异性发夹siRNA干扰片段,并将其克隆插入pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR干扰载体中,构建猪BPI基因4个干扰siRNA表达载体RB1、RB2、RB3和RB4,1个阴性对照NC,并通过PCR和测序进行验证,构建成功后转染猪小肠上皮细胞IPEC-J2并检测其干扰效率。结果发现,所构建的4个特异性siRNA载体均可显著降低猪BPI基因mRNA表达(P<0.05),其中RB4载体干扰效果最好,其干扰效率达到69%。本研究成功筛选可靶向干扰猪BPI基因的高效siRNA,为今后在细胞水平进一步研究BPI基因对猪肠道革兰阴性菌感染抗性的作用及其机制奠定了试验基础。

BPI_(23)-haFGF融合蛋白在毕赤酵母X-33中的分泌表达及活性鉴定

将BPI23-haFGF融合基因克隆到酵母表达载体pPICZαA中,构建出含BPI23-haFGF融合基因的重组质粒pPICZαA-BPI23-haFGF。通过电击将经SacⅠ酶切线性化的pPICZαA-BPI23-haFGF质粒转化到巴斯德毕赤酵母X-33菌中,并通过抗性与表型筛选、PCR鉴定获得高效的工程菌。收集表达上清进行SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明,在43KD有与预期大小相符的条带,占上清总蛋白的50%以上。亲和层析纯化后的融合蛋白BPI23-haFGF纯度约90%,体外活性实验结果,纯化产物具有杀死革兰氏阴性菌及促进NIH3T3细胞增殖的双重功能。