斑点叉尾鮰BPI抗菌肽的cDNA克隆及原核表达载体的构建

杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是生物机体细胞中表达的一种能够特异性杀灭革兰氏阴性菌的抗菌类蛋白,该蛋白包括氨基端和羧基端两个结构域,其中氨基端结构域主要承担杀菌和中和内毒素的功能。参考已经报道的对人类BPI进行重组DNA表达的研究结果,首先通过RT-PCR和巢式PCR从斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)鳃中克隆了编码BPI氨基端活性结构域的cDNA片段"BPI_(Ntd)",该片段由175个氨基酸残基组成,其中63个氨基酸残基在空间上形成一个非极性的脂质结合袋,与革兰氏阴性菌外膜上脂多糖(LPS)结合,从而改变细菌膜的通透性,达到杀菌的效果。根据斑点叉尾鮰与其他生物之间BPI氨基酸序列的比对结果,发现氨基端存在40个保守的氨基酸残基,其中9个高度保守的残基位于脂多糖结合区域内。为了进一步建立原核表达系统,根据pET-32a(+)和pET-28a(+)两种质粒的不同特点,选择其作为原核表达质粒,将"BPI_(Ntd)"片段分别插入两种质粒,通过菌落PCR、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切反应以及DNA测序等方法,证明了重组表达质粒"pET-32a-BPI_(Ntd)"和"pET-28a-BPI_(Ntd)"已被成功构建。