BPI_(23)-haFGF融合蛋白的鉴定及其生物活性研究

目的研究BPI23-haFGF融合蛋白的生物学活性。方法将已构建的酵母重组表达菌株pPICZαA-BPI23-haF-GF/X-33进行甲醇诱导表达,通过亲和层析纯化和冻干浓缩后,观察融合蛋白BPI23-haFGF对细菌、NIH3T3细胞以及小鼠烫伤模型的作用。结果获得纯度约90%的融合蛋白BPI23-haFGF,BPI23-haFGF具有杀菌及促增殖的双重功能,BPI23-haFGF促增殖率与HaFGF标准品相当,当其浓度为0.40g/L时,促NIH3T3细胞增殖率最高(88.7%);在小鼠烫伤模型中,用药组比阴性对照组提前2～3d愈合。结论融合蛋白BPI23-haFGF能够改善小鼠烫伤创面的愈合,为其在临床上的应用奠定了基础。

BPI_(23)-haFGF融合蛋白在毕赤酵母X-33中的分泌表达及活性鉴定

将BPI23-haFGF融合基因克隆到酵母表达载体pPICZαA中,构建出含BPI23-haFGF融合基因的重组质粒pPICZαA-BPI23-haFGF。通过电击将经SacⅠ酶切线性化的pPICZαA-BPI23-haFGF质粒转化到巴斯德毕赤酵母X-33菌中,并通过抗性与表型筛选、PCR鉴定获得高效的工程菌。收集表达上清进行SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明,在43KD有与预期大小相符的条带,占上清总蛋白的50%以上。亲和层析纯化后的融合蛋白BPI23-haFGF纯度约90%,体外活性实验结果,纯化产物具有杀死革兰氏阴性菌及促进NIH3T3细胞增殖的双重功能。

BPI_(23)-haFGF融合蛋白在毕赤酵母中表达条件的优化

目的:通过优化毕赤酵母的表达参数,为提高BPI23-haFGF融合蛋白在毕赤酵母中的表达量创造条件。方法:采用小型摇瓶培养系统,对重组毕赤酵母菌X-33/pPICZαA-BPI23-haFGF在含有蛋白酶抑制剂PMSF以及不同诱导时间、培养温度、甲醇浓度及培养液pH值条件下进行表达,将表达上清进行SDS-PAGE电泳,并用Quantity one Volume Rect Tool和Dentity tool进行分析。结果:在诱导培养基中加入0.5mmol/L PMSF后,BPI23-haFGF融合蛋白降解得到缓解,诱导表达96h表达量达到高峰;在培养温度28℃,甲醇浓度为1.0%,培养液pH 6.0时,BPI23-haFGF表达量最高,含量比优化前提高了91.6%。结论:该研究为BPI23-haFGF融合蛋白后期的大规模发酵及深入研究其生物学功能奠定了基础。