重组BPI_(23)-Fcγ1融合蛋白在CHO细胞中的表达

The fusion gene of BPI 23 and human Fcγ1 was obtained by PCR method,and the expression plasmid was constructed to express recombinant BPI 23 \|Fcγ1 fusion protein in CHO cells.After transfection with the plasmid and selection by methotrexate,the cell lines expressing the fusion protein were obtained.The recombinant protein was purified using cation\|exchange chromatography and its bioactivity was proved with bactericidal assays.

定点突变对BPI_(23)-Fcγ1重组抗菌蛋白表达和复性率的影响

为提高BPI2 3 Fcγ1重组抗菌蛋白在原核表达系统中的表达和复性率 ,采用定点突变法改造 pBV BPI60 0 Fcγ1 70 0 重组表达载体 ,转化E .coliDH5α后 ,通过温控诱导表达。结果表明 :①突变后BPI2 3 Fcγ1重组抗菌蛋白表达量比突变前提高约 1 0 % ;②表达时间提前约 1h ;③抗菌活性未受影响 ;

BPI_(23)-Fcγ1重组抗菌蛋白的研究

该重组抗菌蛋白是采用基因工程技术研制的一种由杀菌/渗透增强蛋白功能性N端片段(BPI23)与IgGlFc片段(Fcγ1)嵌合而成的抗感染生物制剂.目前该课题已取得关键性研究成果,即采用原核表达系统成功地获得了具备BPI和IgG双重功能的非糖基化抗菌蛋白.体外初步研究证实,该重组蛋白不仅具有杀伤G-菌及中和内毒素的作用,而且兼备激活补体和调理作用.

AAV2-BPI_(700)-Fcγ1_(700)重组病毒的制备及其转染小鼠后的抗感染作用

目的通过观测BPI700-Fcγ1700嵌合基因导入小鼠对最小致死量E.coli感染攻击的抵抗作用,探讨基因治疗在细菌感染性疾病中应用的可能性。方法采用RT2PCR检测嵌合基因在转录水平的表达;采用免疫组化和酶联免疫吸附实验检测嵌合基因在蛋白水平的表达。结果(1)基因导入小鼠中目的嵌合基因得到表达,在注射部位肌肉组织和血清中可检测到目的嵌合蛋白;(2)在最小致死量E.coli感染攻击后,基因导入小鼠的存活率为31.43%,明显高于对照组小鼠的存活率4.62%;与小剂量头孢呋辛钠联合应用其存活率高达65%。结论BPI700-Fcγ1700嵌合基因导入小鼠对致死量E.coli感染具有较好抵抗作用,提示抗感染基因治疗在细菌感染性疾病,特别是在感染高危人群中具有广阔的临床应用前景。

AAV2-BPI_(700)-Fcγ1_(700)重组病毒导入小鼠对致死量大肠埃希菌感染的保护作用机制

目的探讨BPI_(700)-Fcγ1_(700)嵌合基因导入,对最小致死量E.coli感染小鼠的保护作用机制。方法采用常规菌落计数法、内毒素和细胞因子检测试剂盒、H-E染色法检测菌落数、内毒素和细胞因子含量及主要器官病理学改变。结果(1)基因导入小鼠血清中的目的基因产物对E.coli具有杀伤作用,可中和内毒素和介导吞噬细胞产生交叉调理吞噬作用;(2)基因导入组小鼠血清、脏器中细菌数明显低于对照组小鼠;(3)基因导入组小鼠血清中内毒素和促炎细胞因子含量显著低于对照组小鼠;(4)对照组濒死小鼠主要脏器血管扩张、淤血明显,与内毒素休克死亡引发的病理学改变相符。结论基因导入组小鼠可通过表达目的基因产物即BPI1-199-Fcγ1嵌合抗菌蛋白,对致死量E.coli感染及其引发的内毒素休克死亡产生抵抗作用。

BPI_(23)-Fcγ1重组融合蛋白在E.coli中的表达

目的 构建pBV BPI60 0 Fcγ170 0 重组表达载体 ,转化E .coliDH5α诱导表达BPI2 3 Fcγ1抗菌重组蛋白。方法 采用RT PCR技术 ,从HL 6 0细胞和正常人白细胞mRNA中扩增编码BPI2 3 和IgG1Fc(Fcγ1)的基因 ;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体 ;转化感受态E .coliDH5α细胞 ,通过温控诱导表达BPI2 3 Fcγ1重组蛋白。结果 (1)RT PCR获得预期的扩增产物BPI60 0bp和Fcγ170 0bp基因片段 ;(2 )成功构建pUC18 BPI180 、pUC18 BPI4 2 0 、pUC18 Fcγ170 0 重组克隆载体 ,DNA测序结果与文献报道一致 ;(3)成功构建pBV BPI60 0 Fcγ170 0 重组表达载体 ,酶切图谱分析与预期结果相符 ;(4 )转化感受态E .coliDH5α细胞 ,通过温控诱导表达BPI2 3 Fcγ1重组蛋白 ,表达量约占菌体蛋白总量的 2 0 %～ 30 % ;(5 )复性后重组蛋白具有抗菌活性和结合蛋白A的作用。结论 pBV BPI60 0 Fcγ170 0 重组表达载体构建成功 ;在E .coli中得到表达 ,获得具有抗菌活性的BPI2 3

rAAV2-BF增强两品系小鼠抗致死剂量细菌感染

目的通过观测rAAV2-BPI1-199-Fcγ1重组病毒(rAAV-BF)感染对不同品系小鼠的抗细菌感染保护作用。方法采用dot blot、Western blot、免疫组化、改良ELISA方法和内毒素检测试剂盒,检测重组BPI1-199-Fcγ1(rBF)蛋白在CHO细胞和小鼠骨骼肌细胞中的表达及血清中内毒素含量的变化;建立最小致死量(MLD)E.coli致死模型,检测rBF基因转染小鼠对MLDE.coli感染的抵抗作用。结果(1)rBF蛋白在CHO细胞和两品系小鼠骨骼肌细胞中成功表达,血清中rBF蛋白具有中和内毒素和杀伤E.coli的作用;(2)在MLDE.coli腹腔感染后,两品系小鼠rAAV-BF感染组存活率均显著高于空载体对照组小鼠;基因转染组小鼠血清内毒素含量明显低于空载体对照组;rAAV-BF感染与头孢呋辛钠联合应用具有协同抗菌作用,两品系小鼠存活率明显高于单纯rAAV-BF感染组。结论rAAV-BF感染组小鼠对致死性E.coli感染具有抵抗作用。