FA/BRCA途径与急性髓系白血病

范可尼贫血（fanconi anaemia,FA）因其高风险进展为急性白血病及实体肿瘤,近年来得到了重视。通过研究其发病机制及与恶性肿瘤的共同途径,对恶性肿瘤的诊断及治疗有重要意义。目前已有研究证明,FA/BRCA途径异常作为FA的主要特点,亦在乳腺癌、肺癌、胰腺癌等肿瘤发病甚至耐药过程中起到重要作用[1]。

FA/BRCA途径参与肺癌细胞对顺铂耐药的机制

目的:研究顺铂(DDP)对肺癌细胞FANCC、FANCF、FANCL表达水平的影响,探讨FA/BRCA途径DNA损伤修复功能在肺癌细胞对顺铂耐药机制中的作用。方法:采用CCK-8法测定经不同浓度顺铂处理24、48 h后两种肺癌细胞株(A549和Calu-1)的细胞增殖抑制率。应用实时荧光定量PCR技术(RFQ-PCR)和蛋白质印迹法检测两类肺癌细胞株中的FANCC、FANCF、FANCL mRNA和蛋白的表达。结果:肺癌A549细胞和Calu-1细胞的增殖抑制率均随顺铂浓度和作用时间的不同而变化,呈剂量依赖性(P<0.05)和时间依赖性(P<0.05),Calu-1细胞的半数抑制浓度(IC50)明显高于A549细胞。肺癌A549细胞除在10μg/ml浓度顺铂处理24 h后FANCF和FANCL mRNA表达水平增高外,2.5～5μg/ml和20μg/ml浓度顺铂时FANCF和FANCL mRNA呈无变化和低表达(P<0.05)。细胞Calu-1经不同浓度顺铂处理后的FANCC和FANCF mRNA表达水平先增高后降低(P<0.05)。肺癌A549细胞中的FANCC、FANCF和FANCL蛋白表达水平随顺铂浓度增高呈进行性降低。而肺癌Calu-1细胞的FANCF蛋白表达水平在顺铂浓度5～10μg/ml范围内较对照组明显增高。结论:Calu-1细胞对顺铂的耐药性显著高于A549细胞,其机制之一可能是FA/BRCA途径中FANCF蛋白高表达的结果。

PARP-1抑制剂PJ-34对多药耐药骨髓瘤细胞株的影响以及与FA／BRCA途径的关系

目的研究PARP-1抑制剂PJ-34对人多发性骨髓瘤多药耐药细胞株RPM18226／R的作用，探讨PJ-34对DNA损伤修复和耐药性的影响以及与FA／BRCA途径的联系。方法应用CCK-8比色法检测细胞抑制率；应用实时荧光定量PCR检测参与FA／BRCA途径对DNA损伤修复的基因表达的变化；采用Western免疫印迹法检测FA／BRCA途径中的关键蛋白FANCD2的表达；用Annexin V-FITC／PI双标法流式细胞术检测PJ-34对细胞凋亡的影响；用彗星实验检测PJ-34对细胞DNA损伤修复的影响。结果PJ-34能够显著增加RPMl8226／R细胞对马法兰的敏感性，使马法兰的IC50值由20．43t2mol／L降至7．8μmol／L；PJ-34能够抑制DNA损伤的修复，且与抑制FA／BRCA途径有关；PJ-34协同马法兰能促进对RPMI8226／R细胞的致凋亡作用。结论PJ-34能够显著增强RPMI8226／R细胞对马法兰的敏感性，通过抑制FA／BRCA途径对DNA损伤的修复来逆转细胞的耐药性，因此，PJ-34可能在克服多发性骨髓瘤多药耐药的治疗中具有一定的临床价值。

姜黄素对多发性骨髓瘤细胞株MOLP-2／R的耐药逆转作用及与FA／BRCA途径的关系

目的研究姜黄素与马法兰联用对人多发性骨髓瘤耐药细胞株MOLP-2／R的耐药逆转作用及其与FA／BRCA途径可能存在的关系，进一步探讨其作用机制。方法采用MTT法检测细胞增殖抑制率；采用Western blot方法检测FA／BRCA途径中的关键蛋白FANCD2单泛素化表达；采用流式细胞术测定细胞周期、细胞内药物浓度及细胞凋亡率。结果姜黄素可增强马法兰对多发性骨髓瘤耐药细胞株MOLP-2／R的毒性，马法兰的阳。值由44．5μmol／L降至19．0μmol／L。该作用是通过抑制FA／BRCA途径中的关键蛋白FANCD2单泛素化来实现的。姜黄素和马法兰联合作用组与单用马法兰组相比，MOLP-2／R细胞的凋亡率由（23．3±0．6）％增至（52．6±0．8）％，G2／M期细胞由9．1％增至18．5％，细胞内药物荧光强度由15．2±0．3增至21．4±0．8。而姜黄素单药作用则无此效应，也不伴有FA／BRCA途径受抑制。结论姜黄素与小剂量马法兰合用可产生协同作用，姜黄素通过抑制FA／BRCA途径中的FANCD2单泛素化来逆转MOLP-2／R细胞对马法兰的耐药性。姜黄素介导的FA／BRCA途径受抑制，能增强马法兰对MOLP-2／R细胞的凋亡诱导及G2／M期阻滞作用，提高细胞内药物浓度。

淋巴瘤细胞系中范可尼贫血／BRCA途径缺陷的探讨

目的寻找维持基因稳定性的范可尼贫血（Fanconi anemia，FA）／BRCA途径发生缺陷与T和B细胞淋巴瘤潜在发病机制的关系。方法筛选19种来源于不同亚型的淋巴瘤细胞系，Western印迹分析相关FA蛋白的表达，细胞生长抑制实验检测丝裂霉素C（mitomycin C，MMC）敏感性，流式细胞仪检测MMC诱导的细胞周期阻滞，染色体断裂试验和DNA测序检测基因的突变。结果在两种淋巴瘤细胞系HT和Sudhl4中，存在FANCN蛋白表达缺失，这种缺失与MMC诱导的G期细胞阻滞、细胞生长抑制增强和较高的染色体断裂发生率结果一致。DNA测序发现HT细胞系中，FANCN基因外显子5a片段中存在点突变c．1769C〉T，P．A590V；Sudhl4细胞系中未发现FANCN的任何突变。结论FANCN基因c．1769C〉T突变可能是导致FANCN蛋白表达缺失或者是使该蛋白不稳定及功能丧失的原因。

siRNA沉默FANCD2基因增加肺癌A549/DDP细胞对顺铂化疗的敏感性

目的:研究siRNA沉默FANCD2基因后人肺腺癌A549/DDP耐药细胞株对顺铂(DDP)耐药性的变化。方法:合成针对FANCD2基因的siRNA(FANCD2-siRNA),采用脂质体将其分别转染肺癌A549细胞株和A549/DDP耐药细胞株。CCK-8法测定经DDP处理的A549和A549/DDP细胞株转染siRNA前后的细胞增殖率变化;免疫印迹法测定2种细胞株转染siRNA前后FANCD2蛋白单泛素化水平;免疫荧光测定胞核中FANCD2蛋白核聚小体的形成。结果:经DDP处理的A549/DDP细胞增殖率,FANCD2蛋白单泛素化水平及核聚小体形成程度明显高于A549细胞。转染FANCD2-siRNA后,A549和A549/DDP细胞的FANCD2蛋白单泛素化水平和核聚小体形成明显降低,细胞增殖率显著下降。结论:应用siRNA转染技术沉默FANCD2基因可抑制FA/BRCA途径的DNA修复功能,从而增加肺癌细胞对DDP的敏感性,部分逆转耐药肺癌细胞株对DDP的耐药性。

siRNA抑制FANCF基因增加肺癌细胞对顺铂的敏感性

目的:研究抑制FA/BRCA途径中的范可尼贫血相关蛋白F(FANCF)基因在增加人肺腺癌CALU-1细胞株对顺铂敏感性中的作用。方法:设计靶向于FANCF基因的3条siRNAs(FANCF-siRNAs),用脂质体转染试剂将其分别转染于CALU-1肺癌细胞株,RT-PCR检测转染后24 h FANCF mRNA的变化;筛选转染效率最高的siRNA片段。蛋白质印迹法检测经顺铂处理的CALU-1细胞株转染siRNA前后FANCF蛋白表达及FANCD2蛋白单泛素化水平;免疫荧光法测定胞核中FANCD2蛋白核聚小体的形成;CCK-8法测定转染siRNA前后的细胞增殖率变化。结果:与转染前比较,CALU-1肺癌细胞株转染FANCF-siRNA后FANCF蛋白表达明显下降,FANCD2蛋白单泛素化水平和核聚小体形成降低,细胞增殖率显著下降。结论:应用siRNA转染技术沉默FANCF基因可明显增加肺癌细胞对顺铂的敏感性,提示在肺癌靶向治疗策略中,FA/BRCA途径中的FANCF基因很可能是一个潜在的分子靶标。

FANCF基因沉默增强多药耐药多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226/R对马法兰的敏感性

目的:使用小片段干扰RNA(siRNA)沉默FANCF基因表达,观察其对FA/BRCA途径的影响及对多药耐药多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226/R对交联剂马法兰的敏感性变化。方法:FANCF siRNA瞬时转染多药耐药细胞株RPMI8226/R,采用CCK-8法检测转染前后细胞对马法兰的敏感性变化,RT-PCR,westernblot法检测FA/BRCA途径中FANCF、FANCD2、BRCA2基因表达量的改变,彗星实验检测DNA损伤,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:FANCF siRNA转染耐药骨髓瘤细胞后,对马法兰的IC50值由17.29μmol/L降至4.88μmol/L;western-blot检测出瞬时转染FANCF siRNA后FA/BRCA途径中FANCF、FANCD2、BRCA2蛋白表达量明显较转染前减低;彗星实验检测出转染后耐药细胞的DNA损伤增多;转染后马法兰诱导细胞凋亡率由(77.67±0.62)%升高至(88.37±0.25)%,提示FANCF基因沉默可使耐药RPMI8226/R细胞对化疗药物马法兰重新恢复敏感性。结论:FANCF基因沉默可抑制FA/BRCA途径中FANCD2及下游BRCA2基因表达,从而阻断FA/BRCA途径介导的DNA修复,增强马法兰对多药耐药骨髓瘤细胞株RPMI8226/R的细胞毒性,增加细胞凋亡率,为解决临床耐药问题提供一个新的思路。

人多发性骨髓瘤耐药细胞系MOLP-2/R的建立及其耐药机制

目的建立耐马法兰的人多发性骨髓瘤细胞系MOLP-2/R,并对其生物学特性及耐药机制进行初步探讨。方法采用马法兰浓度梯度递增法,建立耐马法兰多发性骨髓瘤细胞系。检测两种细胞的形态差异、生长曲线及倍增时间;用药物敏感试验检测两种细胞对马法兰及多种化疗药物的半数抑制浓度(IC50)和耐药指数(RI);使用Western blot比较两种细胞P-gp、MRP和FANCD2的表达差异来探讨可能的耐药机制。结果成功建立了耐药指数为6.03的MOLP-2/R耐药细胞系,与MOLP-2细胞相比,MOLP-2/R耐药细胞异形明显;耐药细胞倍增时间显著延长(P<0.05);MOLP-2/R且对ADM、CTX、DDP、VP-16有交叉耐药;MOLP-2/R中FANCD2的单泛素化表达较MOLP-2明显增加,而P-gp、MRP在耐药细胞系中表达无升高。结论MOLP-2/R具有典型多药耐药特性,为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。FANCD2蛋白单泛素化表达增强可能是MOLP-2/R细胞产生获得性耐药的主要机制之一。

PJ34对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞体外生长及其对马法兰敏感性的影响

目的:观察PJ34对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226体外生长的影响以及与小剂量马法兰的协同作用,初步探讨其作用机制。方法:采用MTT法检测细胞增殖抑制率,Western blot方法检测FA/BRCA途径中的相关蛋白表达、流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率。结果:PJ34能使细胞发生G2/M期阻滞、协同马法兰诱导细胞凋亡作用。PJ34与马法兰联用与单用马法兰相比,细胞凋亡率由(31.08±0.47)%增至(45.38±4.53)%。PJ34介导的FA/BRCA途径相关因子受抑制及γH2AX表达增强,从而抑制DNA的损伤修复。结论:PJ34对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞有显著的抑制作用,并可增加RPMI8226细胞对烷化剂类化疗药物马法兰的敏感性,其作用机制可能是通过抑制FA/BRCA途径对DNA损伤的修复。PJ34与小剂量烷化剂化疗药物合用,是一种安全有效的逆转耐药的治疗方案。