用BrdU标记技术观察大鼠脊髓上胸段灰质细胞的分化发育

目的 观察脊髓灰质细胞的分化发育 ,寻找脊髓移植时胎鼠脊髓取材的最佳时间。 方法 用 5 -溴 -2 -脱氧尿嘧啶 (Brd U)标记 DNA,ABC免疫细胞化学方法观察大鼠上胸段脊髓灰质细胞的增殖分化情况。 结果孕鼠于 E10 d腹腔注射 Brd U,胎鼠脊髓上胸段 Brd U免疫反应神经元主要集中在脊髓后角 ,脊髓侧角的 Brd U免疫反应神经元较少 ,前角仅有少量的 Brd U免疫反应神经元 ;孕鼠于 E11d腹腔注射 Brd U,胎鼠脊髓上胸段后角 Br-d U免疫反应神经元较 E10 d减少 ,侧角和前角 Brd U免疫反应神经元增多 ;孕鼠于 E12 d腹腔注射 Brd U,胎鼠脊髓上胸段 Brd U免疫反应神经元主要集中于前角和侧角 ,而后角仅有少量的 Brd U免疫反应神经元 ;孕鼠于 E13d、E14d腹腔注射 Brd U,胎鼠脊髓上胸段未见 Brd U免疫反应神经元。 结论 Brd U标记技术能较好的标记脊髓灰质细胞 ,胎鼠脊髓进行 Brd U标记的最佳时间应选择 E12 d,已标记胎鼠脊髓的最佳移植取材时间为

咀嚼负荷对幼兔髁突软骨细胞BrdU标记影响的研究

目的探讨咀嚼负荷对幼兔髁突软骨发育及软骨细胞中BrdU标记的影响。方法出生10 d龄的32只幼兔,随机分为喂食固体硬饲料组和喂食粉末软饲料组。连续2周每天每只腹腔注射BrdU(50 mg/kg),在2、4、6、8周时每组处死4只幼兔,HE观察组织形态学变化测量软硬组髁突厚度变化,免疫组化检测BrdU表达。结果髁突软骨前部厚度硬食组明显高于软食组,在中部无明显差异,髁突软骨后部厚度软食组高于硬食组。BrdU免疫组化染色显示,发育期髁突软骨各层及软骨下骨骨髓腔内均有BrdU阳性标记,前部的增殖层表达最显著。第2周,硬食组在前、中、后3个部位的BrdU阳性率都高于软食组;第6周,软食组的中、后部位的阳性率高于硬食组;第8周,软硬组均检测不到阳性细胞。结论软食组在低咀嚼力刺激下,幼兔髁突软骨细胞增殖启动较慢。适当的咀嚼压力能促进髁突软骨细胞的增殖,同时幼兔发育期的髁突生长还受到基因等内环境因素影响。

BrdU标记观察肝癌细胞的营养

目的:对肝动脉栓塞后,门静脉分支对肝癌的营养情况进行观察。方法:将BrdU注入24例肝癌病人将被切除肝 段的门静脉分支内,标本用BrdU单克隆抗体进行免疫组化染色,然后用标记指数(L1)分析,同时检测被标记的S-期细胞分布。结果:TAE(动脉导管栓塞)室病人的L1值比没有TAE的病人高五倍,有显著差别(P<0.001=,标记的细胞不仅分布在肿瘤的周边部分还分布在中心部分。结论:在TAE后的阶段,门静脉对残存的肝癌的血供发挥主要的作用.肝癌切除后的化疗不仅通过肝动脉而且应通过门静脉.

Brdu和PCNA标记观察丹参酮对癌细胞增殖的影响

为了解丹参酮的抗癌作用并探索其机理，用丹参酮处理人肝癌细胞株和白血病细胞株，Ｂｒｄｕ掺入标记和ＰＣＮＡ免疫组化染色检测癌细胞增殖动力学指标。结果：丹参酮处理人肝癌细胞和白血病细胞株后，Ｂｒｄｕ标记率分别为８．９５％，１９．０１％，均显著低于对照组（２８．０％，２５．５７％，Ｐ＜０．０１）；ＰＣＮＡ阳性率分别为５７．０％，３０．３２％，均显著低于对照组（７４．３％，４７．０５％，Ｐ＜０．０１）。结果表明，Ｂｒｄｕ标记和ＰＣＮＡ检测在研究肿瘤细胞增殖及影响因素等方面有重要应用价值，丹参酮抑制癌细胞增殖与抑制癌细胞ＤＮＡ合成、ＰＣＮＡ表达及ＤＮＡ多聚酶δ活性等有关。

荜茇提取物对大鼠骨髓间质干细胞MSC的增殖作用及与化学官能团的关系

目的:观察荜茇挥发油和水溶性部分对大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)体外增殖的影响,并进一步探讨了与分子中化学官能团的关系。方法:使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞,体外培养,经Brdu标记和CD44染色及两者双重染色鉴定后,观察在培养液中添加不同浓度荜茇挥发油及其水溶性部分的条件下MSC的生长变化。应用形态学、MTT法和5-溴脱氧尿嘧啶(5-Bromodeoxyuridine,Brdu)、增殖细胞核抗原(Proliferationcellnuclearantigen,PCNA)免疫细胞化学方法测定细胞增殖活性。结果:荜茇挥发油以浓度依赖方式促进MSC增殖活力和增加Brdu、PCNA阳性细胞数,与对照组比较有显著性(P<0.05)。经GC-MS检测,荜茇挥发油含C=C(50.66%)、-OH(27.02%)、多种官能团(5.05%)等;而荜茇水提物对MSC无增殖作用。结论:荜茇挥发油明显促进MSC的增殖,这种作用可能与分子中C=C、-OH等官能团有关。

反映成年大鼠脑组织神经发生水平显示方法的灵敏性和可靠性评价

目的评价反映成年大鼠脑组织神经发生水平的显示方法。方法采用免疫细胞化学法观察溴化脱氧尿核苷(BrdU)显示细胞增殖的可靠性、灵敏性,以及寻找BrdU给药的合适剂量。结果BrdU25mg/kg剂量组与50mg/kg、100mg/kg组相比,齿状回BrdU阳性细胞数差异明显(P<0.05),50mg/kg和100mg/kg两组无显著性差异(P>0.05)。BrdU25mg/kg剂量组阳性细胞不易与周围细胞区分;50mg/kg剂量组和100mg/kg剂量组阳性细胞较易识别。且BrdU阳性细胞大多数分化为神经元。结论BrdU标记法可以准确反映成年大鼠脑组织神经发生水平。

神经干细胞移植对缺氧缺血新生大鼠感觉运动机能的影响

目的研究神经干细胞(NSCs)移植对改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后感觉运动障碍的作用。方法7d龄新生SD大鼠,随机分为假手术组,HIBD组和脑内移植组,后两组HIBD损伤后3d分别在左侧感觉运动皮质区植入BrdU标记的NSCs或培养基作为对照,观察植入4周后大鼠感觉运动功能的变化和移植细胞在脑内的存活和分化情况。结果与HIBD组比较,移植组在T迷宫和四项感觉运动功能测试中,表现出明显的改善。在T迷宫中,自发改变率[(69.23±13.34)%vs(45.00±27.27)%](P<0.05)上升;在握持牵引试验中,握持时间明显延长[(49.15±13.39)svs(27.20±15.18)s](P<0.05);在肢体放置和足错误试验中的不对称性消失,姿势反射也明显改善(P<0.05)。BrdU间接免疫荧光显示移植后4周,在脑内可见存活的NSCs分布于移植点附近;BrdU和NF-200免疫荧光双标显示移植后4周NSCs可部分分化为神经元表达NF-200。结论脑内移植NSCs对HIBD新生大鼠的感觉运动机能和行为的恢复有良好的促进作用。

成年肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓细胞增殖的研究

目的观察成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内源性细胞的增殖和存活情况。方法对ALS转基因鼠进行BrdU注射,分别于不同时间点取材,冷冻切片,应用免疫荧光染色技术检测脊髓内细胞的增殖、分布和存活情况。结果成年ALS鼠脊髓的中央管、灰质、白质均可检测到BrdU阳性细胞,经常可检测到形状相似、成对出现的细胞。在灰质内,BrdU阳性细胞主要分布于脊髓前角。在白质内,BrdU阳性细胞散在分布。前角ALS鼠脊髓内BrdU阳性细胞数量较野生型鼠多。BrdU末次注射后1d、14d均可检测到BrdU阳性细胞,但细胞数量逐渐减少,28d ALS鼠脊髓内仍可检测到少量BrdU阳性细胞,主要分布于中央管部位。增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞的分布和变化规律与BrdU阳性细胞一致。在95d龄ALS鼠(BrdU末次注射1d后),脊髓中Nestin阳性细胞较野生型鼠多,多数Nestin阳性细胞分布于脊髓前角,某些细胞呈BrdU/Nestin双标阳性。在BrdU注射后14d、28d脊髓中,未检测到BrdU/Nestin双标阳性细胞。结论神经退行性病变可激活ALS转基因鼠脊髓的细胞增殖,且细胞存活可达28d。

局灶性脑缺血后老年大鼠室管膜下区和颗粒下层细胞增殖与分化的实验研究

目的观察老年大鼠局灶性脑缺血后室管膜下区(SVZ)和颗粒下层(SGZ)神经干细胞的增殖与分化。方法取老年大鼠制作大脑中动脉梗塞模型。用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)脉冲标记结合免疫组织化学单标记技术,观察正常组、假手术组、脑缺血后3、71、4、212、8 d组SVZ和SGZ区BrdU阳性细胞的变化;用BrdU累积标记结合免疫组织化学双标技术,观察脑缺血14 d后SVZ和SGZ区BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双标阳性细胞的数量。结果在正常组、假手术组及各脑缺血组大鼠的双侧SVZ和SGZ均可观察到BrdU阳性细胞。与正常组和假手术组相比,脑缺血后SVZ和SGZ区BrdU阳性细胞明显增加。缺血组SVZ区BrdU阳性细胞在脑缺血后7 d时达到高峰,28 d时仍高于正常水平;SGZ区BrdU阳性细胞在脑缺血后14 d时达到高峰,28 d时仍高于正常水平。通过BrdU累积标记和免疫组织化学双标发现:脑缺血14 d后,老年大鼠SVZ区有部分细胞显示BrdU/NeuN(0.98%)或BrdU/GFAP(12.56%)双标阳性,而SGZ区未见双标细胞。结论局灶性脑缺血可激活老年大鼠室管膜下区和颗粒下层的神经干细胞明显增殖,并且室管膜下区有部分增殖细胞可分化为神经元或神经胶质。

微小颗粒骨移植诱导细胞生长治疗大鼠骨缺损

目的:观察自体微小颗粒骨对骨髓基质细胞(MSCs)的诱导作用及复合MSCs移植修复大鼠骨缺损的治疗效果.方法:全骨髓培养法获得大鼠MSCs,分别以块状骨和微小颗粒骨诱导MSCs,半定量RTPCR,免疫组化测定细胞碱性磷酸酶(ALP),骨钙素(OCN)和Ι型胶原的表达.制作大鼠颅骨缺损动物模型,培养同种异体新生大鼠的MSCs,复合自体颗粒骨后植入骨缺损区,X线摄片观察骨愈合情况;5溴脱氧尿嘧啶(BRDU)标记观察移植细胞成活情况.结果:MSCs与颗粒骨混合培养,ALP,OCN和Ι型胶原的表达高峰提前,表达水平高于块状骨.植入微小颗粒骨复合MSCs组颅骨缺损愈合优于单纯植入微小颗粒骨,可见BRDU标记细胞存活.结论:微小颗粒骨具有骨诱导活性,复合MSCs移植修复颅骨缺损,缺损愈合加快,移植细胞可存活.

兔组织工程肌的构建与研究

目的 探讨用同种异体兔成肌细胞和小肠黏膜下层( small instestinel submucosa,SIS)复合,体外培养构建兔组织工程肌。 方法 取出生7d内幼兔四肢肌组织,经多步酶消化法与差速贴壁法获得足量、纯净成肌细胞,用Brd U标记,与SIS体外复合培养构建组织工程肌,植入15只异体兔体内修复腓肠肌1.5 cm×1.0 cm大小的骨骼肌缺损作为实验组;用单纯SIS修复对侧同样骨骼肌缺损作为对照组。术后4、6和8周各处死5只动物取材,行大体和组织学观察、局部细胞免疫定量分析和免疫组织化学检测。 结果 体外培养成肌细胞与SIS均复合良好,体内植入4周见材料与周围肌组织接合紧密,周围炎性反应明显;6周和8周材料开始部分降解,炎性反应逐渐减轻。局部细胞免疫定量分析显示实验组和对照组4、6周评分与8周评分比较有统计学意义( P<0 .0 5 )。实验组4、6和8周均可见材料周围新生肌组织形成,Brd U及肌球蛋白免疫组织化学染色阳性,对照组染色结果呈阴性。 结论 成肌细胞与SIS复合构建的组织工程肌,植入体内可存活。

环境中微生物原位检测方法研究进展

微生物是生态系统物质循环和能量流动的主要参与者,在生态系统中起着重要的作用。但在现有技术条件下可培养微生物所占比例极小,限制了微生物资源的开发利用。目前有许多方法,可以避开微生物不可培养的问题,直接对微生物进行原位检测。对此,将前人关于微生物生态的原位检测研究方法进行了综述,方便以后对这些方法的合理应用。分别从DNA水平、RNA水平和蛋白质水平,介绍了对应的原位微生物检测方法(如Brd U标记、DNA-SIP、FISH和环境转录物组等),比较了它们的优缺点,并介绍了如何将这些方法与目前流行的高通量测序、单细胞测序等技术相结合来捕获原位活性微生物组等。同时,还对这些方法的特点进行了比较,使得人们可以更清楚地了解在不同场景下对不同方法的选择。这些经过改进的新兴方法及其与其它方法的结合使用将有助于解决微生物生态学研究中出现过或即将出现的很多问题。地球上的各种生态系统复杂而庞大,包含的微生物种群也各有差异。各种原位检测方法对微生物生理生态做出了更加真实有效的描述,必将成为研究微生物生态的有力手段。

眶下神经CCI模型中三叉神经节内卫星胶质细胞的增殖

神经损伤后，感觉神经节内发生细胞增殖。虽然通过增殖细胞的形态学和位置特点，初步推断增殖细胞为卫星胶质细胞，但是增殖细胞的具体类型和特性尚不清楚。本研究采用BrdU标记和免疫荧光双标的方法，试图解决以下3个问题：①在眶下神经CCI模型中，增殖细胞除了包括卫星胶质细胞，

人骨髓间充质干细胞与汗腺细胞共同培养诱导细胞表型转化的初步研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells,hMSCs)在体外与损伤的人汗腺细胞(humansweatglandcells,hSGCs)共培养时的转化情况。方法体外分别分离培养和扩增hMSCs和hSGCs,用二步免疫细胞化学法检测hMSCs和hSGCs抗原表达情况。用5μmol/L的5溴2脱氧尿苷(BrdU)对培养的hMSCs进行连续培养标记。待原代培养的hSGCs达70%融合后,给予47℃高温处理40min造成热损伤体外模型,37℃冷却12h,然后加入(12)×105BrdU标记的hMSCs共同培养,2周后,以抗癌胚抗原(CEA)和抗BrdU单克隆抗体作为一抗,采用免疫细胞化学双染法检测共培养的细胞。结果hMSCs和hSGCs均呈克隆样生长,hMSCs表达CD44和CD105,不表达CD34和CEA;hSGCs表达CK7、CK8、CK19、CEA。用BrdU标记hMSCs阳性率可达90%,hSGCs经高温损伤后,大多数细胞的细胞间连接消失。共培养2周后,部分细胞同时表达CEA和BrdU,并有多核现象。细胞染色示双染细胞可达1%～5%,多核细胞且核染色不同的细胞约为0.01%～0.05%,多核细胞与其他双染细胞相比,细胞明显的宽大扁平。结论在损伤的微环境下,hMSCs可以向hSGCs转化,其机制可能是细胞分化、细胞融合甚至是核融合。

食蟹猴骨髓源性神经干细胞自体脑内移植的研究

目的探讨食蟹猴自体骨髓基质细胞诱导分化成神经干细胞后移植到脑内的生长情况.方法对6只食蟹猴进行骨髓基质干细胞体外培养、诱导分化成神经干细胞,经BrdU标记后进行自体脑移植.动物分为即时移植组和延迟移植组,采用立体定向多点注射的方法将神经干细胞悬液移植到猴皮层创伤灶.结果HE染色显示即时移植和延迟移植的创伤区细胞数量都明显多于假移植治疗对照;免疫组织化学染色显示两组动物在干细胞移植后1～6个月脑皮层创伤灶内均有BrdU阳性表达细胞,移植后半年的动物在移植区邻近的脑白质内也可观察到有BrdU阳性表达的细胞,而创伤对照动物、假移植治疗动物和正常脑组织中则未见BrdU阳性表达. 结论BMSCs体外培养得到的神经干细胞经过自体移植能在脑皮层内存活,并且能增殖、分化和迁移,可成为神经干细胞的替代细胞或来源细胞;干细胞移植到陈旧性的脑皮层损伤灶也具有成活、增殖和迁移能力.

新生鼠缺氧缺血性脑损伤后内源性神经干细胞的增殖及迁移

目的观察新生鼠缺氧缺血损伤后内源性神经干细胞的增殖及迁移。方法制成新生鼠缺氧缺血脑损伤模型,采用单、双标免疫组织化学方法检测5溴脱氧尿苷(BrdU)和巢蛋白(Nestin)的表达。BrdU标记增殖的新生细胞,Nestin标记神经干细胞。结果正常新生鼠生后保持较短一段时间的增殖活跃,生后3d达高峰,7d后逐渐减弱,生后21d后形成与成年动物相似的发生模式。缺氧缺血损伤后,细胞增殖恢复活跃,BrdU阳性细胞数于伤后4d达高峰,皮层、纹状体、海马可见散在阳性细胞,大多数BrdU阳性细胞集中位于室管膜下区的背外侧角及外侧壁处,伤后7d后逐渐减少,21d更多的BrdU阳性细胞迁移至损伤区;损伤后Nestin阳性细胞数增加,同时一定数量的Nestin阳性细胞由G0期进入增殖周期。结论缺氧缺血脑损伤可刺激新生鼠内源性神经干细胞的增殖及迁移。