BRE-AS启动子负调控区变异与启动子活性、母猪繁殖力的关系

[目的]本试验旨在研究BRE反义lncRNA(BRE antisense lncRNA,BRE-AS)基因启动子负调控区(PNRR)序列特征,以及变异位点多态性与母猪繁殖性状、启动子活性的关系。[方法]采用DNA测序法获得大白猪BRE-AS基因PNRR序列;利用池DNA测序筛选大白猪BRE-AS基因PNRR上的变异位点,DNA测序法进行基因分型;利用GLM模型进行变异位点多态性、单倍型与母猪繁殖性状的关联分析;利用荧光素酶报告系统分析变异对BRE-AS基因启动子活性的影响。[结果]大白猪BRE-AS基因的PNRR位于-952~-161 nt,长度792 bp。在大白猪BRE-AS基因PNRR的-794和-756 nt处发现了2个变异位点,分别将其命名为g.-794T>G和g.-756A>C。在大白猪群体中BRE-AS基因g.-794T>G位点有3种基因型,其中TT型为优势基因型(0.752),T为优势等位基因(0.863);在g.-756A>C位点有3种基因型,其中AA型为优势基因型(0.759),A为优势等位基因(0.868);2个变异位点形成3种合并基因型,其中TT/AA型为优势基因型(0.760),T-A为优势单倍型(0.869)。关联分析发现2个位点及其合并基因型均与母猪总产仔数(TNB)、产活仔数(NBA)和健仔数(NSP)等3个繁殖性状间显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)关联。荧光素酶活性分析发现G-C单倍型启动子活性极显著高于T-A单倍型(P<0.01)。[结论]BRE-AS是大白猪繁殖性状的候选基因,其PNRR上2个变异位点(g.-794T>G和g.-756A>C)通过影响启动子活性影响其母猪繁殖力。

LncRNA BRE-AS1在急性心肌梗死患者血清中表达及对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响

目的探究lncRNA BRE-AS1在急性心肌梗死(AMI)患者血清中表达和对缺氧/复氧(H/R)诱导心肌细胞AC16损伤的影响。方法QPCR检测AMI患者血清和H/R处理12 h、24 h、48 h后AC16细胞中lncRNA BRE-AS1表达;将lncRNA BRE-AS1 siRNA和对照siRNA转染至AC16细胞中,qPCR检测检测转染后细胞中lncRNA BRE-AS1表达;利用试剂盒检测细胞中氧化应激指标MDA、SOD和GSH-PX含量,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中p38/MAPK信号通路蛋白表达。结果与健康志愿者和常氧组AC16细胞相比,AMI患者血清和H/R处理12 h、24 h、48 h后细胞中lncRNA BRE-AS1表达显著增加(P<0.01)。与沉默对照组比较,沉默BRE-AS1组AC16细胞中lncRNA BRE-AS1表达显著降低(P<0.01)。与常氧组比较,H/R组AC16细胞中MDA含量、细胞凋亡率、p38/MAPK信号通路蛋白p-p38、p-ERK1/2表达显著增加,SOD和GSH-PX含量及细胞增殖能力显著降低(P<0.01);与H/R+沉默对照组比较,H/R+沉默BRE-AS1组AC16细胞中MDA含量、细胞凋亡率、p38/MAPK信号通路蛋白p-p38、p-ERK1/2表达显著降低,SOD和GSH-PX含量及细胞增殖能力显著增加(P<0.01)。结论LncRNA BRE-AS1在AMI患者血清中高表达,沉默lncRNA BRE-AS1能够抑制H/R诱导的心肌细胞损伤,其机制可能与抑制p38/MAPK信号通路有关。

长链非编码RNA BRE-AS1慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建长链非编码RNA BRE-AS1的慢病毒表达载体。方法利用重叠延伸PCR法构建出BRE-AS1的全长目的片段,将全长目的片段及慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCSEF1分别双酶切后进行连接,转化到感受态大肠杆菌后,通过DNA测序鉴定筛选出阳性菌落,提取目的质粒。利用目的质粒制备包装慢病毒,并感染肾细胞癌细胞系OS-RC-2,分别利用荧光显微镜和荧光实时定量PCR检测细胞中BRE-AS1是否过表达。结果重叠延伸PCR得到正确的BRE-AS1全长序列,经过双酶切、连接、转化、筛选及DNA测序,成功构建重组慢病毒载体质粒pCDHBRE-AS1。通过荧光显微镜检测,几乎所有经过嘌呤霉素筛选的OS-RC-2细胞均具有绿色荧光,显示其被重组慢病毒感染;荧光实时定量PCR显示,感染了pCDH-BRE-AS1慢病毒的OS-RC-2细胞中,BRE-AS1的表达水平上升了38.5倍。EdU插入实验显示BRE-AS1抑制肾癌细胞的增殖。结论本研究成功构建了BRE-AS1的慢病毒表达载体,并证明BRE-AS1能抑制肾癌细胞增殖。

lncRNA BRE-AS1调控Wnt/β-catenin信号通路影响宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭和凋亡的实验研究

目的:探讨lncRNA BRE-AS1对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其机制。方法:采用实时荧光定量PCR检测人子宫颈上皮永生化细胞系H8和宫颈癌细胞系SiHa中lncRNA BRE-AS1的表达水平。将对数生长期的SiHa细胞分为未转染组(正常培养)、阴性对照组(转染空载体)和lncRNA BRE-AS1组(转染lncRNA BRE-AS1表达载体),采用实时荧光定量PCR检测各细胞中lncRNA BRE-AS1的表达水平,噻唑蓝法检测细胞增殖能力,平板克隆实验细胞克隆形成能力,Transwell小室检测细胞侵袭能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,免疫印迹法检测细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和c-Myc的表达。结果:与人子宫颈上皮永生化细胞系H8相比,宫颈癌细胞系SiHa中lncRNA BRE-AS1的表达水平明显降低(P<0.01)。与未转染组相比,lncRNA BRE-AS1组细胞中lncRNA BRE-AS1的表达水平和细胞凋亡率明显升高,且细胞增殖活力、克隆形成率、穿膜细胞数和细胞中β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05);而阴性对照组和未转染组相比,上述指标均未见明显改变(P>0.05)。结论:lncRNA BRE-AS1可抑制宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭并促进其凋亡,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

长链非编码RNABRE-AS1在非小细胞肺癌中的表达及其调控功能

[背景]非小细胞肺癌(NSCLC)是严重危害人类健康的恶性肿瘤,长链非编码RNA(lncRNA)可能在其发生发展中发挥重要作用。[目的]探讨lncRNA BRE-AS1在NSCLC中的表达、生物学功能和调控作用,为进一步了解NSCLC发病机制提供理论依据。[方法]利用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术对91例来自南京胸科医院的原发性NSCLC患者的癌组织和癌旁组织以及NSCLC细胞中BRE-AS1表达水平进行检测,应用TCGA RNASeqV2系统分析TCGA数据库中BRE-AS1在1016例NSCLC组织和110例正常组织中的表达水平。应用受试者工作特征(ROC)曲线评价BRE-AS1对NSCLC的诊断价值,应用t检验分析不同临床特征NSCLC患者的BRE-AS1表达水平。采用慢病毒转染在NSCLC细胞A549中构建BRE-AS1过表达稳转细胞株,分别以CCK8法和流式细胞术检测BRE-AS1对细胞增殖、周期及凋亡的影响。通过功能富集分析BRE-AS1的下游信号通路并用Western blotting法检测信号通路中关键蛋白表达水平。[结果]RT-qPCR和TCGA数据库分析结果显示BRE-AS1在NSCLC组织[RT-qPCR:差异表达倍数(FC)=-13.15,TCGA:FC=-4.85,P<0.05]和NSCLC细胞A549(FC=-4.87,P<0.05)中表达下调。ROC分析结果显示BRE-AS1对NSCLC具有较强的诊断能力(NSCLC组织:曲线下面积为0.916,95%CI:0.872~0.960;TCGA数据库:曲线下面积为0.853,95%CI:0.809~0.897)。CCK8结果显示,在A549细胞中过表达BRE-AS1后,细胞增殖能力在24、36、48 h降低(P<0.01);同时流式细胞术分析显示,过表达BRE-AS1阻滞A549细胞周期于G2/M期,并诱导细胞凋亡率上升(P<0.05)。功能富集分析发现,磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路与NSCLC发生发展相关(P<0.05),进一步Western blotting法分析发现,过表达BRE-AS1后,A549细胞中AKT3、p-AKT3、m TOR、p-mTOR表达以及p-AKT3/AKT3、p-mTOR/mTOR均下降,PTEN表达上升,提示过表达BRE-AS1可抑制A549细胞中PI3K-AKT-mTOR信号通路。[结论]BRE-AS1在NSCLC中表达下调,具有较高诊断价值。BRE-AS1可能通过抑制PI3KAKT-mTOR信号传导途径降低A549细胞生长活力,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,进而影响NSCLC发生发展。