丙烯酰胺诱导BRL-3A鼠肝细胞中环氧合酶-2表达

环氧合酶-2(COX-2)在肿瘤的发生、发展和侵袭过程中发挥了重要的作用。丙烯酰胺是存在于环境和食品中的一种潜在致癌物质,但目前鲜见丙烯酰胺能否诱导正常肝细胞中COX-2表达的研究报道。本研究采用蛋白质免疫印迹检测丙烯酰胺对BRL-3A鼠正常肝细胞中COX-2表达的诱导作用,发现丙烯酰胺能够以浓度依赖和时间依赖的方式诱导BRL-3A大鼠正常肝细胞中COX-2表达,表明丙烯酰胺有可能通过诱导正常肝细胞中COX-2表达而参与肿瘤的发生和发展过程。

TGF-β1对大鼠肝细胞系BRL-3A凋亡和细胞周期的影响

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠肝细胞系BRL-3A凋亡和细胞周期的影响.方法:MTT法检测TGF-β1对细胞增殖的影响:将BRL-3A细胞分为6组,分别给予不同浓度的TGF-β1(0、2、4、6、8、10μg/L),检测各组细胞24、36、48h时的增殖活性;进一步将BRL-3A细胞分为TGF-β1处理组和对照组,分别给予和不予TGF-β1(8μg/L),进行如下检测:流式细胞仪检测两组细胞24、36、48h时的凋亡情况和细胞周期分布;实时定量RT-PCR检测两组细胞24、36、48h时CyclinE、Cdk-2、EGF、HGF、Bcl-2、c-Myc、MMP9、NF-κB基因的表达变化.结果:MTT结果显示,各浓度TGF-β1组在24、36、48h时的细胞增殖活性差异无统计学意义;流式细胞仪分析结果显示,TGF-β1处理组24、36、48h时的细胞凋亡率和细胞周期分布与对照组间的差异均无统计学意义;实时定量RT-PCR发现,TGF-β1处理组相对于对照组,CyclinEmRNA、Cdk2mRNA、EGFmRNA在24h时分别下调至0.194±0.103、0.181±0.064、0.634±0.116倍,36h时分别下调至0.379±0.173、0.457±0.123、0.619±0.112倍,48h时分别上调至1.956±0.215、2.17±0.471、7.66±0.437倍;HGFmRNA在24、36、48h时均明显下调,分别至0.152±0.068、0.146±0.053、0.158±0.061倍;Bcl-2mRNA在24、36h时无统计学差异,48h时上调至1.567±0.115倍;c-MycmRNA、MMP9mRNA、NF-κBmRNA在3个时刻均上调,24h时分别至1.742±0.389、3.484±0.411、1.625±0.369倍,36h时分别至2.292±0.361、1.563±0.323、1.486±0.494倍,48h时分别至2.499±0.475、2.233±0.493、3.612±0.364倍.以上基因表达差异均有统计学意义(P<0.05).结论:大鼠肝细胞系BRL-3A对TGF-β1促凋亡和细胞周期阻滞作用的敏感性低下,可能与非Smads途径的激活,NF-κB、Bcl-2、c-Myc、MMP9表达的上调有关.

新蛋白C7orf42促进大鼠肝细胞BRL-3A增殖

目的探讨未知功能蛋白C7orf42对体外培养的大鼠肝细胞BRL-3A增殖的影响。方法基因干涉下调C7orf42表达后,用MTT、Ed U掺入法检测C7orf42对BRL-3A细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期进程以及Reat-time PCR和Western blotting检测细胞增殖相关基因表达。结果 MTT法检测表明,转染C7orf42干涉片段后48h,干涉组比阴性对照组细胞活力降低11%(P<0.05);Ed U掺入法检测表明,实验组的Ed U阳性细胞比率比对照组降低了13%(P<0.05);流式细胞术检测表明,干涉组比阴性对照组S+G2/M期的细胞数降低12%(P<0.05);Reat-time PCR检测表明,干涉C7orf42表达后细胞增殖相关基因JUN、CCND1、MYC和CCNA2的表达分别下调26%、31%、37%和14%(P<0.05);Western blotting检测表明,干涉C7orf42表达后细胞增殖相关蛋白JUN、CCND1、MYC和CCNA2的表达分别下调59%、54%、18%和27%(P<0.05)。结论 C7orf42可能通过上调细胞增殖相关蛋白JUN、CCND1、MYC和CCNA2的表达,促进体外培养的大鼠肝细胞BRL-3A增殖。

丙烯腈致大鼠肝细胞损伤中PI3K/AKT信号通路的 作用

为探讨丙烯腈(acrylonitrile,ACN)致大鼠肝细胞损伤中PI3K/AKT信号通路的作用,随机将60只雄性SD大鼠分为5组:对照组,ACN低、中、高剂量染毒组和干预组。分别给予玉米油,11.5 mg·kg^(-1)、23.0 mg·kg^(-1)、46.0 mg·kg^(-1) ACN和300 mg·kg^(-1) N-乙酰基半胱氨酸(NAC)+46.0 mg·kg^(-1) ACN灌胃染毒,灌胃容积为5.0 mL·kg^(-1),1次·d^(-1),6 d·周-1,共28 d。最后一次染毒1 d后,大鼠麻醉心脏采血后处死,取肝脏进行实验。(1)原位末端标记法(TUNEL)观察肝细胞凋亡水平;(2)定量逆转录聚合酶链反应法(qRT-PCR)检测pi3k、akt、bad、bcl-2、cyt c和caspase-3基因表达水平;(3)免疫印迹法(WB)检测PI3K/AKT信号通路和线粒体凋亡通路相关蛋白的表达水平。研究表明:(1)细胞凋亡方面。ACN低、中剂量组凋亡细胞较对照组显著增多(P<0.05)。(2)mRNA相对表达水平方面。与对照组相比,ACN低剂量组bad、caspase-3显著升高(P<0.05),bcl-2显著降低(P<0.05);ACN中剂量组pi3k、bcl-2降低(P<0.05),cyt c升高(P<0.05);ACN高剂量组pi3k、bcl-2降低,bad升高(P<0.05);ACN各剂量组akt无显著差异(P>0.05);NAC组bad较ACN高剂量组降低(P<0.05)。(3)蛋白相对表达水平方面。与对照组相比,ACN低剂量组pro-Caspase-3降低,cleaved-Caspase-3升高(P<0.05);ACN中剂量组PI3K、p-Bad和pro-Caspase-3降低,Caspase-9、Bad、Bax和Cyt c升高,Bcl-2/Bax值降低(P<0.05);ACN高剂量组p-PI3K、p-AKT、Bcl-2、p-Bad和pro-Caspase-3降低,Bad、Bax、Caspase-9、Cyt c和cleaved-Caspase-3升高,Bcl-2/Bax值降低(P<0.05);ACN各剂量组AKT无显著差异(P>0.05)。与ACN高剂量组相比,NAC组PI3K、p-Bad和pro-Caspase-3升高,Bax、Caspase-9和cleaved-Caspase-3降低(P<0.05)。ACN抑制PI3K/AKT信号通路及激活线粒体凋亡途径可能是大鼠肝细胞损伤的原因之一。

地塞米松对大鼠肝细胞BRL-3A增殖和凋亡的影响

目的探讨地塞米松对体外培养大鼠肝细胞BRL-3A增殖和凋亡的影响。方法用不同浓度的地塞米松处理BRL-3A细胞,于12、24、48、72、120 h后用MTT检测地塞米松对BRL-3A细胞活性的影响,同时分别用Annexin V-FITC双染法、PI单染色法、实时定量-聚合酶链反应(Real-time PCR)等方法检测地塞米松对BRL-3A细胞周期和凋亡的影响。结果 MTT检测表明,地塞米松能够抑制BRL-3A细胞的活性;Annexin V-FITC双染法分析显示,地塞米松具有显著促进BRL-3A细胞凋亡的效果;PI单染色法检测细胞周期分布情况表明,地塞米松处理后的细胞与对照组相比增殖能力减弱;用Real-time PCR检测促细胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和促增殖基因Ccnd1和Jun的mRNA表达情况,结果显示,用地塞米松处理后的细胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9均表达上调,而Ccnd1和Jun均表达下调,说明地塞米松能促进BRL-3A细胞的凋亡。结论地塞米松可以促进BRL-3A细胞的凋亡,并抑制其增殖。

MiR-382促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖

目的探讨miR-382对大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖和凋亡的影响。方法 BRL-3A细胞瞬时转染miR-382的模拟物和抑制物48 h,MTT法测定细胞活性;流式细胞术检测细胞周期;Real-time PCR检测细胞增殖和凋亡相关基因的表达情况。结果在大鼠BRL-3A细胞中,转染模拟物可以显著增加miR-382的表达,转染抑制物可以显著降低miR-382的表达(P<0.01)。MTT检测表明,miR-382过表达后,BRL-3A细胞活性明显提高;流式细胞术检测表明,miR-382过表达组S期的细胞数明显增加,而miR-382干涉组S期的细胞数明显减少;用Real-time PCR检测细胞增殖/凋亡相关基因mRNA表达水平表明,miR-382过表达后,BRL-3A细胞增殖相关基因增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2和Ccnd1的mRNA表达水平上调,细胞凋亡相关基因Caspase-3和Bax的mRNA表达水平下调,而miR-382干涉组与上述结果相反。结论 miR-382通过促进细胞增殖相关基因表达,抑制细胞凋亡相关基因表达而促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖。

紫杉醇、多西紫杉醇对大鼠肝细胞株BRL-3A细胞缝隙连接功能的影响

目的观察紫杉醇、多西紫杉醇对大鼠肝细胞株BRL-3A细胞缝隙连接(GJ)功能的影响。方法采用磺酰罗丹明B比色法筛选紫杉醇和多西紫杉醇不影响BRL-3A细胞生长的作用浓度。采用细胞接种荧光示踪法与划痕标记染料示踪技术检测紫杉醇与多西紫杉醇作用BRL-3A后细胞GJ功能。结果筛选出的紫杉醇、多西紫杉醇药物浓度均为0.01、0.1、0.5、1.0μmol/L。与溶剂对照组相比,0.01、0.1、0.5、1.0μmol/L紫杉醇处理的BRL-3A细胞Calcein荧光传递率降低(P均<0.05),多西紫杉醇处理的BRL-3A细胞Calcein荧光传递率无明显变化。与溶剂对照组相比,紫杉醇作用细胞后LY向邻近细胞传递距离缩短,多西紫杉醇作用细胞后LY向邻近细胞传递距离无明显变化。结论紫杉醇可显著抑制大鼠肝细胞株BRL-3A细胞GJ功能,而多西紫杉醇则不影响GJ功能。

骨髓间充质干细胞诱导肝纤维化大鼠肝星状细胞凋亡和Caspase-3表达

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导肝纤维化大鼠肝星状细胞(HSCs)凋亡及Caspase-3表达。方法分离培养大鼠MSCs。将肝纤维化模型SD大鼠60只平均分为A(鼠尾静脉注射等量的生理盐水)、B(鼠尾静脉注射含MSCs细胞悬液)、C(鼠尾静脉注射经肝细胞生长因子诱导14 d后的MSCs细胞悬液)组。鼠尾静脉输注2×105MSCs细胞悬液,于第1、2、3、4周末取肝组织,经HE、Masson染色观察肝纤维化程度,用TUNEL法检测各组HSCs凋亡,免疫组化检测Desmin,RT-PCR和Western Blot检测凋亡因子Caspase-3。结果 B、C两组肝组织学改善明显,肝纤维化程度减轻,HSCs数量明显减少,Desmin、TUNEL染色阳性的细胞均增多,Caspase-3基因mRNA和蛋白表达增强,且呈时间依赖性,与A组比较差异有统计学意义,且C组较B组明显(P<0.01,P<0.05)。结论 MSCs可在体内诱导HSCs凋亡并上调Caspase-3表达,肝细胞生长因子诱导MSCs抗肝纤维化较单纯MSCs作用更强。

人参皂甙Rg3在小鼠肝癌淋巴结转移模型中诱导细胞凋亡的作用

目的:观察人参皂甙Rg3对小鼠肝癌淋巴结转移模型中肿瘤细胞凋亡的诱导作用,探讨人参皂甙Rg3抗肿瘤淋巴结转移的机制。方法:建立小鼠肝癌淋巴结转移模型;光镜和透射电镜下观察各组(Rg3预防组、Rg3治疗组、Rg3与顺铂联合治疗组、顺铂治疗组及对照组)中原发瘤及转移瘤组织的形态学结构改变,并通过流式细胞仪分析肿瘤细胞的凋亡。结果:Rg3预防组及治疗组电镜下(5份样品)可见较多细胞凋亡小体的形成(5/5,4/5);顺铂治疗组的形态改变以细胞破坏为主,凋亡的细胞较少;联合治疗组细胞的凋亡和坏死程度相当。流式细胞学检测分析结果为:Rg3预防组、治疗组及联合治疗组均见细胞凋亡的特征峰(5/5),而顺铂治疗组为1/5,对照组未见凋亡峰(0/5)。结论:人参皂甙Rg3抗肿瘤细胞淋巴结转移的作用与诱导细胞凋亡有关。

山楂黄酮对BRL-3A肝细胞DNA损伤的修复作用及其机制

目的:探讨山楂黄酮对BRL-3A肝细胞DNA损伤的影响及其机制。方法:MTT法检测不同浓度的山楂黄酮对乙醇损伤肝细胞的影响;单细胞凝胶电泳分析细胞DNA的损伤程度并计算Olive尾距;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等生理生化指标;实时定量PCR检测基因SOD的表达变化。结果:0.2,0.4和0.8 mg/mL的山楂黄酮能够显著修复乙醇诱导BRL-3A肝细胞的DNA损伤,这种修复作用与细胞抗氧化指标SOD、MDA和GSH-Px的改善密切相关。结论:山楂黄酮能够通过抗氧化修复肝细胞的DNA损伤,山楂黄酮具备潜在的肝损伤治疗价值。

MiR-199a-3p对大鼠肝细胞增殖的抑制作用

目的探讨miR-199a-3p对体外培养SD大鼠BRL-3A增殖的影响.方法人工合成miR-199a-3p模拟物、miR-199a-3p阻遏物及其各自阴性对照载体,分别转染BRL-3A肝细胞,转染后12 h、24 h、48 h和72h,应用定量PCR分析细胞中Cyclin D1和PCNA mRNA表达水平,免疫组化方法观测Cyclin D1和PCNA阳性细胞比率,流式细胞仪检测细胞各周期比例和CCK 8法检测细胞增殖.实验分4组:mimics组,mi-nc组,inhibitors组和in-nc组.结果转染后24 h、48 h、72 h,inhibitors组肝细胞Cyclin D1和PCNA mRNA表达水平较in-nc组显著增多(P<0.05),而mimics组肝细胞Cyclin D1和PCNA mRNA表达水平较mi-nc组显著降低(P<0.05).inhibitors组肝细胞Cyclin D1和PCNA阳性细胞比率均高于mi-nc组(P<0.05),而mimics组肝细胞Cyclin D1和PCNA阳性细胞比率均低于mi-nc组(P<0.05).inhibitorss组肝细胞G0/G1期细胞比例明显低于in-nc组(P<0.05),而mimics组肝细胞G0/G1期细胞比例明显高于mi-nc组(P<0.05).同时,inhibitors组肝细胞S期细胞比例明显低于mi-nc组(P<0.05)和in-nc组(P<0.05).inhibitors组肝细胞增殖能力明显高于in-nc组(P<0.05),mimics组肝细胞增殖能力明显低于mi-nc组(P<0.05).结论 miR-199a-3p能够延长大鼠BRL-3A肝细胞周期和抑制肝细胞增殖,其作用可能与抑制Cyclin D1和PCNA的表达有关.

丹芍化纤方对体外大鼠肝细胞增生、Caspase-3mRNA及白蛋白合成的影响

目的:探讨丹芍化纤方抗肝纤维化的作用机制方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Ficoll密度梯度离心的方法, 分离、培养大鼠肝细胞,加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞,用MTT法测定肝细胞的增生,荧光实时定量PT-PCR(Real Time RT—PCR)法检测肝细胞内天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达,并检测培养上清中的白蛋白. 结果:丹芍化纤方药物血清对肝细胞的增生及白蛋白合成有促进作用,能显著下调肝细胞内caspase-3mRNA的表达, 其表达水平与正常大鼠血清组比较有显著性差异,呈明显的浓度依赖关系. 结论:丹芍化纤方发挥抗肝纤维化作用与其促进肝细胞增生、蛋白合成功能,抑制肝细胞凋亡有关.

三七总皂苷对大鼠肝移植物细胞凋亡及Bcl-2和Caspase-3表达的影响

目的 探讨三七总皂苷(PNS)预处理对大鼠供肝缺血 再灌注损伤的保护作用及其对供肝细胞凋亡和Bcl 2及Caspase 3 mRNA表达的影响。方法 雄性SD大鼠分别用作供、受体,采用Kamada’s袖套法建立原位肝移植模型,根据供肝切取前1 h是否静脉注射 PNS(50 mg/kg)将大鼠随机分为 PNS预处理组(PNS组)和生理盐水对照组(NS组); 另设假手术作对照组(SO组)。分别于供肝再灌注后 2 h、6 h及 24 h处死各组动物,检测血清 ALT及AST,HE切片作病理组织学检查,TUNEL法检测肝细胞凋亡,RT PCR法检测Bcl 2及Caspase 3 mR NA的表达。结果 供肝再灌注后2 h、6 h及24 h各时点,PNS组大鼠血清 ALT和 AST水平及肝细胞凋亡指数(AI)均明显低于NS组(P<0.05,P<0.01); 6 h及24 h,PNS组大鼠肝组织Bcl 2 mRNA的表达水平明显高于NS组(P<0.05); 2 h及6 h,PNS组大鼠肝组织Caspase 3 mRNA的表达水平明显低于NS组(P<0.05)。结论 PNS预处理大鼠供肝,可以有效地减轻移植肝的缺血/再灌注损伤和细胞凋亡,影响细胞凋亡调控基因 Bcl 2 和Caspase 3的表达。这可能为PNS抗细胞凋亡的机理之一。

大鼠酒精性肝病细胞凋亡中Caspase-3、NF-κB的表达

目的:观察大鼠酒精性肝病组织病理形态学改变,探讨细胞凋亡与Caspase-3、NF-κB的表达及意义。方法:采用灌胃法制备大鼠酒精性肝病(ALD)模型,模型组用40%酒精8g/(kg·d)分两次灌胃共12周,对照组灌等量的生理盐水,实验第8、12周末分批处死动物。用HE染色和电镜分别观察肝组织病理变化和肝细胞超微结构变化,用TUNEL法检测肝细胞的凋亡,用免疫组化法检测Caspase-3、NF-κB的表达。结果:模型组肝细胞凋亡明显增多,主要分布在中央静脉周围,点状、灶状坏死区;Caspase-3、NF-κB主要分布在中央静脉及肝细胞坏死灶周围细胞的胞质中,模型组Caspase-3、NF-κB表达强度明显高于对照组,且NF-κB的表达与Caspase-3的表达呈正相关。结论:大鼠酒精性肝病的发生、发展过程中Caspase-3、NF-κB参与肝细胞凋亡。

调控Tim-3通路在免疫性肝损伤大鼠中对Th17细胞的影响

目的建立免疫性肝损伤模型,探讨Tim-3通路在阻断或激活时对Th17细胞的影响。方法大鼠尾静脉注射刀豆蛋白A(Con A)8周,建立免疫性肝损伤模型。无菌取脾脏制备脾淋巴细胞,取外周血分离血清后于-20℃保存,取肝脏组织放入4%的多聚甲醛中固定备用。在96孔板上将脾淋巴细胞平均分成5组,即阻断实验组、阻断对照组、激活实验组、激活对照组和Con A对照组。用Tim-3的单克隆抗体即Anti-Tim-3来阻断Tim-3通路;用Tim-3的重组配体galectin-9来激活Tim-3通路,37℃、5%CO2培养箱中培养72 h,收集细胞上清液于-20℃保存。生化分析法测血清中ALT、AST和ALB的表达;HE染色观察肝脏组织的病理变化;免疫组化法测肝脏组织中IL-17A和ROR-γt蛋白的表达;ELISA法测细胞上清液中IL-17A及IL-6的表达;实时定量PCR测各组脾淋巴细胞ROR-γt mRNA的表达。结果与对照组相比,模型组HE染色可见明显的炎性细胞浸润、肝脏组织损伤及较多的假小叶,免疫组化可见IL-17A和ROR-γt蛋白的表达明显升高;与阻断对照组相比,阻断实验组中IL-17A和IL-6的水平升高(P<0.05);与激活对照组相比,激活实验组中IL-17A和IL-6的水平降低(P<0.05);实时定量PCR显示与阻断对照组相比,阻断实验组中ROR-γt mRNA的表达明显增加(P<0.05)。结论免疫性肝损伤的发病与Th17细胞密切相关,免疫调控Tim-3通路可通过影响Th17细胞效应,进而参与免疫性肝损伤的发病机制。

因宁片对甲亢大鼠肝细胞凋亡调节蛋白Caspase-3和Bcl-2表达的影响

目的观察因宁片对甲亢大鼠肝细胞凋亡调节蛋白半胱天冬酶-3(Caspase-3)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)表达的影响,探讨因宁片对甲亢肝损害的保护作用及其机制。方法对SD大鼠灌胃甲状腺片1.2 g/(kg.d)制备甲亢肝损害模型。因宁片低(0.6 g/kg)、中(1.2 g/kg)、高(2.4 g/kg)剂量组和甲亢灵组(1.2 g/kg)均灌胃给药,治疗30 d后处死大鼠,取血和肝脏。用放射免疫法测血清三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH),全自动生化仪测血清天门冬酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT),Western-Blot检测Caspase-3蛋白、Bcl-2蛋白表达。结果与空白对照组相比,模型组大鼠血T3和T4水平明显升高,TSH水平下降(P<0.01),AST和ALT水平升高(P<0.01),Caspase-3蛋白表达明显升高,Bcl-2蛋白表达显著下降(P<0.01)。与模型组比较,因宁片高、中、低剂量组血中T3,T4,AST,ALT水平均明显降低,TSH水平均明显升高(P<0.05),因宁片高、中剂量组Caspase-3蛋白表达明显下调(P<0.01和P<0.05),Bcl-2蛋白表达明显上调(P<0.01),且因宁片高剂量组的改变最明显。结论因宁片对甲亢合并肝损害有预防作用,其作用机制可能与抑制肝细胞凋亡有关。

NM23B对大鼠肝细胞体外增殖的影响

目的观察NM23B在体外培养大鼠肝细胞增殖中的作用。方法构建NM23B过表达载体和干扰载体及其阴性对照载体,分别转染SD大鼠BRL-3A肝细胞,并设空白对照组(CON)、干扰NC组(siRNA-NC)、干扰组(siRNA)、过表达组(OE)、过表达NC组(OE-NC),通过定量PCR分析各组细胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA变化;Western印迹分析比较各组细胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA蛋白的变化;流式细胞仪检测各组细胞周期比例;用CCK 8法检测细胞增殖。结果 OE组Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表达量较CON组显著增多(P<0.05);另一方面,siRNA组的Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表达量较CON组显著降低(P<0.05),干扰NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异(P>0.05)。OE组的G0/G1期细胞比例明显低于CON组(P<0.05),siRNA组的G_0/G_1期细胞比例明显高于CON组(P<0.05)。同时,OE组的S期细胞比例明显高于CON组(P<0.05),siRNA组的S期细胞比例明显低于CON组(P<0.05),siRNA-NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异(P>0.05)。CCK-8检测细胞增殖表明OE组的增殖速度明显快于CON组(P<0.05),siRNA组的增殖速度明显慢于CON组(P<0.05),siRNA-NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异(P>0.05)。结论过表达NM23B可以加强Cyclin D1、PCNA的表达,缩短细胞周期,从而促进肝细胞增殖;干扰NM23B表达则削弱了Cyclin D1、PCNA的表达,延长细胞周期,从而抑制肝细胞增殖。证实了NM23B在体外培养SD大鼠肝细胞增殖中的作用,为后续体内实验奠定了理论基础。

大鼠GSK3β基因RNAi腺病毒载体的构建与鉴定及其对肝卵圆细胞增殖的促进作用

目的构建并鉴定特异性大鼠糖原合成酶激酶3β(GSK3β)基因siRNA腺病毒载体,观察其对肝卵圆细胞系WB-F344增殖的影响。方法用DNA重组技术将针对GSK3β基因不同部位所设计的2对shRNA序列克隆到高效RNAi真核表达质粒载体pGenesil-1.1中,构建shRNA表达载体pGenesil-1.1-GSK3β。分别酶切重组质粒及pDC312载体,转化连接,构建腺病毒载体pDC312-GSK3β,PCR扩增与鉴定。脂质体法介导腺病毒载体与骨架质粒pPE3-F11共转染293细胞,包装产生腺病毒颗粒AdD C3 12-GSK3β并测定滴度。取病毒上清感染WB-F34 4细胞,荧光显微镜观察细胞荧光含量,Western blotting检测GSK3β蛋白表达。CCK-8测定转染前后WBF-344增殖变化。结果经PCR酶切及Western blotting技术证实成功构建了针对大鼠GSK3β基因RNAi质粒pGenesil-1.1-GSK3β及GSK3β基因RNAi重组腺病毒载体AdDC312-GSK3β。Western blotting证实该重组腺病毒载体可抑制WBF-344细胞GSK3β的表达。CCK-8结果显示干扰GSK3β可促进WBF-344细胞增殖。结论成功构建了针对GSK3β基因RNAi的腺病毒载体,并在大鼠肝卵圆细胞系WBF-344中稳定表达,促进细胞增殖。