BRL-CM小鼠胚胎干细胞及体外诱导的研究

目的 探讨以Buffalo大鼠肝细胞培养上清 (BRL -CM )替代含LIF培养液体外培养小鼠胚胎干细胞(ESC)的可行性 ;无血清体外诱导ESC为神经前体细胞 (NPC)。方法 以BRL -CM维持ESC生长并抑制其分化 ,用含LIF的培养液作为对照 ,硝基四氮唑蓝 /5-溴 -4氯 -3 -吲哚基磷酸 (NBT/BCIP)显色检测碱性磷酸酶。采用N2选择性无血清培养法获取NPC ,免疫组化法检测巢蛋白 (Nestin)鉴定。结果 BRL -CM与含LIP的培养液一样能维持ESC未分化状态 ,无血清培养基诱导ESC后获得细胞的 86%为NPC。结论 BRL -CM可替代LIF用于ESC培养 ,且经济、简便。采用N2 选择性培养基可获得较高纯度的NPC。

BRL-CM在昆白小鼠胚胎干细胞分离培养中的应用

目的:探讨Buffalo大鼠肝细胞条件培养基(BRL-CM)在昆白小鼠胚胎干细胞(ES)分离培养中的应用。方法:用BRL-CM培养生长在STO(一种小鼠成纤维细胞)饲养层上的昆白小鼠的桑椹胚和囊胚,然后由囊胚内细胞团(ICM)得到ES细胞集落,在有饲养层和无饲养层时用BRL-CM培养分离得到的ES集落。结果:桑椹胚在上述培养条件下能发育成囊胚,然后囊胚在饲养层上长出ICM;用0.1%Trypsin-0.016%EDTA离散ICM,接种到饲养层上培养得到ES集落,ES集落能维持早期传代。结论:在分离培养昆白小鼠的ES细胞时,BRL-CM结合STO饲养层可以用来培养桑椹胚和囊胚,桑椹胚可以发育为囊胚并孵出内细胞团;同时,这种培养条件也能维持昆白小鼠ES细胞的增殖和早期传代。

pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞建系的研究

本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs),优化鸡胚胎干细胞培养体系,以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系。在获得hTERT基因后,构建重组质粒pEGFPhTERT,并利用FuGENE^(?)HD转染鸡成纤维细胞(DF-1),转染24 h后,荧光显微镜检测;再以80%BRL-CM(大鼠肝细胞条件培养基)与20%的ES基础培养液混合的条件培养基培养分离的cES:s,添加10μmol·L^(-1)维生素C,AKP染色以及相关表面抗原SSEA-1、SOX2和OCT4检测鉴定后,以G418筛选pEGFP-hTERT转染的cES:s,传代培养后荧光定量PCR检测相关干性基因的表达水平。结果表明:维生素C可以促进cESCs增殖,pEGFP—hTERT转染的DF-1细胞中可以检测到绿色荧光表达,pEGFP—hTERT转染的cESCs可持续传至10代以上,且仍保持未分化状态,干细胞表面特异性抗原检测呈阳性,且相关干性基因的表达水平差异不显著(P>0.05)。综上表明:pEGFP-hTERT转染的cESCs在80%BRL-CM结合外源因子的作用下,能够持续稳定传至10代且仍保持未分化状态,可应用于鸡胚胎干细胞的永生化和细胞系建立。