新生牛小肠粘膜细胞轮状病毒受体的研制Ⅱ、抗BRV受体McAb对MA104细胞的保护试验

在生长成单层的MA104细胞中加入抗BRV受体McAb,及用抗-BRV中和后的抗BRV受体McAb,37℃作用1小时,再感染BRV。结果表明抗BRV受体McAb既能保护MA104细胞不受BRV的感染,又能代替BRV和抗-BRV发生抗原抗体的特异性结合反应。同时表明我室建立的筛选杂交瘤细胞的ELISA法的可靠性。

粒细胞集落刺激因子及其McAb的研究

利用B细胞杂交瘤技术,用rhG-CSF免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,成功地建立了3株能持续分泌特异抗rhG-CSF McAb的杂交瘤细胞。取其中2D_4-B_4杂交瘤细胞进行染色体数目测定,并将2D_4-B_4瘤细胞注入小鼠腹腔,获得抗体阳性腹水,测定提纯抗体IgG亚型、特异性、稳定性和亲和力,证实该McAb可以和hG-CSF及小鼠G-CSF特异结合。为进一步研究hG-CSF和人工合成G-CSF打下良好的基础。

分泌抗人IgMμ链McAb杂交瘤细胞株的建立

本文从正常人（HBSAg阴性）血清中分离纯化人IgM，以此作为抗原免疫BALB／C小鼠，根据kohler和Milstein杂交瘤细胞建株原理，采用本室建立的常规方法，将免疫脾细胞和小鼠SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，建立了分泌抗人IgMμ链单克隆抗体杂交瘤细胞株。经过间接ELISA双向琼脂扩散试验及封闭试验等方法证实，所分泌的抗体为抗人IgMμ链McAb，其中3A4、3D32株杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代，均能分泌高效价抗体，且为IgG1亚类。本实验结果为抗人IgM鼠队嵌合抗体基因的构建奠定了基础。

应用生物反应器大规模培养杂交瘤细胞生产体内治疗用WuT3单克隆抗体

用3．5L和14L生物反应器培养WUT3杂交瘤细胞，结果表明用人血清可以代替牛血清培养WuT3细胞，在1％人血清培养液中添加适当营养成分，可达到10％小牛血清浓度下的细胞浓度（1．5×106／ml）和单抗产量（大于50μg／ml）。放大到75L生物反应器中采用半连续方式培养，建立了中试培养工艺流程和质控点，收获时细胞浓度为1.0×106～1．5×106／ml，单抗产量为40～70μg／ml，平均日产单抗达1g。在3．5L、14L、75L逐级放大培养过程中，细胞支原体为阴性，收获上清中单抗免疫活性合格，热原试验合格。

应用光敏生物素标记探针检测杂交瘤细胞中小鼠白血病病毒

采用BamHⅠ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术，从重组质粒pSF11中回收5kb小鼠白血病病毒（MuLv）DNA片段，用光敏生物素标记制备DNA探针，采用斑点杂交法检测杂交癌细胞，McAb纯品以及SP2／0细胞中的MuLv。结果表明，此探针特异性好，灵敏度可达25pg。在检测的13株杂交瘤细胞和2株SP2／0细胞中分别有5株和1株为MuLv阳性，在McAb纯品中未查出MuLv。

抗rhTNFα杂交瘤细胞的体外培养及抗体分泌的研究

采用非CO2依赖培养基（CO2-IM）在无CO2、37℃条件下培养抗rhTNFα杂交瘤细胞，培养1周PH无显著变化，细胞生长趋势和抗体分泌显著超过DMEM。将CO2－IM与SFPF－HM混合后添加ITSE可以培养抗rhTNF杂交瘤细胞，其细胞生长速率、密度、活力和抗体产量均达到或超过含血清培养。

抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究

目的建立分泌抗华支睾吸虫代谢抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法用华支睾吸虫成虫代谢抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株,测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价,检测单抗与日本血吸虫全虫可溶性抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应。结果获得3株分泌高滴度抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应,3株单抗均属IgG。结论制备的抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗,为制备免疫诊断试剂盒奠定了基础。

抗兔晶状体上皮细胞单克隆抗体的制备及特异性研究

目的 为防治白内障术后因晶状体上皮细胞增殖而产生的后发性白内障 ,制备抗家兔晶状体上皮细胞的单克隆抗体 ,从而更进一步以其为载体与细胞毒素偶联 ,特异性抑制晶状体上皮细胞生长而不损伤眼内其他组织 ,为防治后发性白内障奠定实验基础。方法 应用家兔晶状体上皮细胞与佐剂混合 ,免疫 BAL B/ c小鼠 ,通过聚乙二醇 (PEG -40 0 0 )使被免疫的小鼠脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞融合 ,细胞融合之后 ,经过 HAT选择性培养液培养 ,用间接免疫荧光抗体法和免疫组化 SP法检测杂交瘤细胞上清夜中的抗体 ,筛选出呈阳性反应的杂交瘤细胞 ,再经 3次甲基纤维素克隆化培养以保证单克隆抗体的特性 ,最后将此单克隆抗体对人眼组织进行交叉反应。结果 被免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2 /0通过 PEG-40 0 0融合后 ,经 HAT选择性培养 ,16 d后杂交瘤细胞克隆产生 ,对其进行 3次甲基纤维素培养基克隆化培养 ,获得检测抗体阳性率达 10 0 %的克隆系为一株。用免疫组化 SP法检测此抗体仅对兔晶状体上皮细胞抗原呈阳性反应 ,而对兔眼角膜、虹膜、人眼角膜、虹膜、晶状体上皮细胞呈阴性反应。结论 成功制备了抗家兔晶状体上皮细胞的单克隆抗体 ,此单克隆抗体具有较强的特异性 ,对人眼组织无交叉反应 。

抗华支睾吸虫单克隆抗体的制备和鉴定

目的：建立分泌抗华支睾吸虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株并进行鉴定。方法：用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫虫卵抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位。结果：获得５株分泌高滴度抗华支睾吸虫成虫单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应；５株单抗均属ＩｇＭ；单抗所识别的抗原定位于华支睾吸虫肠管壁。结论：制备的抗华支睾吸虫成虫的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

在MDBK细胞上增殖牛病毒性腹泻病毒(BVDV)HN 1 株,用蔗糖密度梯度离心法纯化后免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞并与NS0 骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,3次有限稀释法克隆,得到4株能稳定分泌抗BVDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株:3A8、3C7、3C11和3E9。经鉴定,3A8、3C7、3E9株为IgG1亚类,3C11株为IgG2a亚类;杂交瘤细胞的平均染色体数目为99 条。3A8、3C7、3E9、3C11 与BCV、BRV均无交叉反应,但3A8、3C7、3E9与HCV、BDV存在交叉反应,而3C11与HCV、BDV无交叉反应,3C11显示出较好的特异性;杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA效价分别为1∶1 000 和1∶200 000,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。这些McAb的获得为BVDV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。

新颖抗猪流行性腹泻免疫制剂

以新生乳猪增殖猪流行性腹泻病毒（PEDV），通过蔗糖密度梯度离心纯化，获得结构较为完整的病毒颗粒，病毒ELISA效价为1：3×105，蛋白含量为3．96mg／mL．将提纯的PEDV免疫Balb／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合．融合率为95．6％。用间接ELISA筛选并进行3次再克隆，阳性率达100％，共获用15株能稳定分泌特异性抗PEDV单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞．其染色体数平均为90～100．所分泌抗体具有高度特异性，腹水ELISA效价为1：103～1：106。用混合单抗对新生猪的保护试验证明，这些单抗不论在体内或体外．对PEDV均有中和作用．试验绪可以得到抗体的保护耐过不死，而病毒对照组的猪只全部死亡。将混合单抗用于PED的发病场，保护率达91％．建立了PPA－ELISA、McAb阻断ELISA及MCAb免疫荧光试验等快速诊断方法．

抗腺病毒五邻体单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA方法的建立

为获得稳定性好、特异性强、效价高的抗腺病毒五邻体单克隆抗体,用腺病毒五邻体基因工程表达抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,以腺病毒五邻体为筛选抗原对融合后的杂交瘤细胞间接ELISA进行筛选.结果表明:试验获得5株杂交瘤细胞,标记为3C4、4C4、4D7、4F2和4H3,4D7免疫球蛋白亚类为IgG2a,其余4株为IgG1;对5株细胞连续3个月体外传代试验和小鼠腹水连续传代试验,5株细胞都能持续稳定分泌单克隆抗体,对细胞上清和腹水采用间接ELISA进行效价测定,细胞上清效价稳定维持在2 000左右,腹水效价稳定维持在200 000以上,且与引起腹泻的鼠伤寒沙门氏菌和轮状病毒无交叉反应;对其中可以配对的2株单抗4D7、4F2建立双抗夹心ELISA,可以应用于临床检测腺病毒.

兔出血热病毒单克隆抗体的研究

本文应用杂交瘤技术,将兔出血热病毒免疫的 BALB/C 小白鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP_2/O 在PEG 存在下进行融合。杂交瘤细胞经 HAT 筛选,用间接 ELISA 法检测相应的阳性抗体。经三次克隆化及三个多月的传代扩大培养,获4株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,编号为84、83、44、19,其腹水滴度为1:1×10^(-5),1:1×10^(-4),1:1×10^(-5)及1:1×10^(-4)。经分类测定其免疫球蛋白均属于 IgG。亚类测定除44号属 IgG_(2a)外,其他均属 IgG_1。从阻断试验看,单抗的作用能被兔特异性抗血清所阻断,则证明84号腹水具有抗兔出血热病毒的特异性。应用 ELISA 法测定非标记抗体间对抗原的反应增值,说明83与44号间的反应增值很低,可能是识别同一个抗原决定簇,而84及19号则分别识别其他两个不同的抗原决定簇。同时也讨论了单克隆抗体发展的远景。

分泌抗细粒棘球蚴单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文采用棘球蚴囊壁生发层制备抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞与骨髓瘤ＳＰ２／Ｏ进行细胞融合，经多次筛选克隆后建立了分泌抗细粒棘球蚴单克隆抗体细胞株Ｃ＿５Ｆ＿２Ｃ＿（１１）Ａ＿（１１），Ｃ＿（１２）Ｃ＿（１１）Ｆ＿６Ｇ＿３，Ｃ＿（１２）Ｈ＿（１２）Ｆ＿８Ｄ＿５三株。应用ＥＬＩＳＡ及免疫组化法检测该三株具有特异性，培养上清分泌抗体滴度分别为１：２５６０，１：５１２０，１：５１２０。注入同系小鼠腹腔诱生肿瘤产生单抗滴度分别为１：１０２４０００，１：４０９６０００，１：２０４８０００。杂交瘤细胞株经组织培养传代，分泌的抗体性能稳定。分泌抗细粒棘球蚴抗体杂交瘤细胞株的建立，对包虫病的免疫学诊断和治疗具有重要的价值和意义。

抗牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以从黑龙江省腹泻犊牛粪便中分离的牛轮状病毒(bovine rotavirus)为抗原,免疫6～8周龄BALB/_c小鼠,取血清抗体阳性小鼠的脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞融合。用ELISA间接法检测抗体,通过有限稀释法,克隆出一株分泌抗牛轮状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定,此杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为IgM,轻链为K链。通过连续传代证明,此杂交瘤细胞株具有稳定分泌单克隆抗体的性质。杂交瘤细胞诱生BALB/_c小鼠腹水的单克隆抗体滴度可达1:10000以上。

抗绵羊进行性肺炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用提纯的OPPV细胞抗原免疫BALB/c小鼠脾脏与SP2/0小鼠骨髓细胞融合,融合率为70%,以ELISA双抗体夹心法进行检测,阳性率为20%,经过有限稀释法克隆出1A_6、2B_8、1G_3、2G_44株分泌抗OPPV抗原的单克隆体杂交瘤细胞株。选择抗体分泌滴度高的1A_6细胞进行了较详细的研究,结果表明,其核内染色体数为96～110条,抗体属性为IgG1,轻链为K链,IFA试验表明产生的McAb对OPPV有特异性,细胞传30代并在液氮中保存半年后复苏仍能稳定地分泌抗OPPV McAb,细胞分泌抗体的ELISA滴度腹水为6.4×10~4,上清为640,McAb经硫基乙醇还原后在SDS-PAG上呈现2条区带,一条为重链部分,MW50000,另一条为轻链部分,MW为25000。

抗KDR-Fc杂交瘤细胞系的建立

用杂交瘤技术建立抗KDRFc的杂交瘤细胞系,以KDRFc抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ELISA间接法检测和有限稀释法克隆培养,再经稳定性检测、效价检测,筛选出分泌抗KDRFc单克隆抗体的杂交瘤细胞.得到了10株能持续分泌抗KDRFc的单克隆抗体的细胞株,其中3株分泌的单抗具有较高的生物活性、特异性和稳定性.

分泌抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

利用超滤膜超滤浓缩法纯化的鸡传染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus)疫苗株 D78免疫 BALB/ c小鼠。取其脾细胞与 SP2 / 0骨髓瘤细胞进行融合 ,经筛选克隆 ,成功地建立了 13株分泌抗 IBDV D78的杂交瘤细胞株 ,这些杂交瘤细胞株的稳定性好、特异性强 ,腹水和无血清培养上清 (浓缩 30倍 )中 Mc Abs的效价分别达 16 6和 10

抗人IgG-抗HRP双特异性单克隆抗体的研制及初步应用

用8－AG（8－氮杂鸟嘌呤）驯化的HRP－MCAb（抗辣根过氧化物酶单克隆抗体）杂交瘤细胞HAT（次黄嘌呤氨基喋呤胸苷）敏感株与人IgG免疫的BALB／c小鼠脾细胞进行二次融合，获得5株能稳定分泌抗人IgG－抗HRP的BsMcAb（双特异性单克隆抗体）杂交－杂交癌细胞，用其混合腹水经HRP亲和层析纯化的BsMcAb制备BsMcAbPAP（双特异性单抗过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物）试剂代替丙肝诊断试剂盒中酶标二抗，比较结果初步表明两者差异无显著意义，将为IgG的检测提供有用试剂。