甘蓝夜蛾高毒力Bt菌株的筛选

东北农业大学昆虫教研室从黑龙江地区病死鳞翅目昆虫体内分离出苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）菌株７４株，随后以甘蓝夜蛾为供试昆虫对这些菌株的毒力进行了测定，结果表明，很多菌株对甘蓝夜初孵幼虫均具有一定的毒力，经过初筛，复筛，试验选出毒力相对较高的５个菌株，当菌液浓度在８×１０＾７个芽胞·ｍＬ＾－１时，甘蓝夜蛾死亡率分别达到８０％～９５％，Ｌｃ５０分别为４３，６３，６８，

几株Bt菌株对紫外线的抗性探讨

采用不同照射时间的紫外光 (UV)对 1株野生型Bt菌株及 3株Bt菌株Bt0 0 1、Bt2 0 0、Bt0 87进行照射处理后再置于双碟上培养 16h ,结果表明 ,Bt野生菌株在UV处理 3min后已基本全部失活 ,而Bt0 0 1、Bt2 0 0、Bt0 87在UV处理 8min后仍有活性。从UV处理时间的长短及平板上出现菌落数的多少得知 ,尽管菌株Bt0 0 1、Bt2 0 0、Bt0 87对UV的抗性都比野生Bt菌株强得多 ,但并不相等。其中 ,Bt2 0 0相对弱些 ,UV处理 9min后已无菌落 ;Bt0 87最弱 ,UV处理 8min后已无菌落 ;而菌株Bt0 0 1对UV的抗性最强 ,UV处理 13min后仍有菌落出现。这说明不同的Bt菌株 ,其遗传背景是不同的。另外 ,Bt0 0 1经紫外线照射 9min ,培养 16h后发现有 9个菌落发生明显的变异 ,菌落呈棕黄色 ,菌落明显比原始菌落小。涂片 ,油镜下观察其菌体要比原始菌体小 。

对粘虫高毒力Bt菌株的筛选

以粘虫的初孵幼虫为供试昆虫,对东北农业大学植物保护系昆虫教研室从哈尔滨地区病死的昆虫体内分离、保存的苏云金芽孢杆茵(Bacillus thuringiensis,以下简称Bt)74个菌株进行了筛选。经初筛、复筛,从中筛选出对粘虫初孵幼虫高素力Bt菌株5株,它们的菌株号分别为31,42,72,78,87号,当菌液浓度为1.60×10 8芽孢/mL时,粘虫初孵幼虫校正死亡率分别为80％～95％,它们的致死中浓度Lc50分别为3.56×10 6芽孢/mL、4.60×10 5芽孢/mL、4.47×10 6芽孢/mL、5.49×10 6芽孢/mL、2.43×10 6芽孢/mL。

拮抗核盘菌Bt菌株的筛选及抑菌活性研究

利用平板对峙试验从170株Bt菌株中筛选获得12株对核盘菌Sclerotinia sclerotiorum有抑菌活性的菌株,对其中4株活性较强的菌株进行抗病相关基因分析,发现菌株中都含有几丁质酶基因,测定4AP1菌株发酵液的几丁质酶活力为672.4U/mL。通过对4AP1菌株pH和温度敏感性的研究发现,4AP1菌株最高可耐受55℃高温及pH 12缓冲液的处理,抑菌活性与对照无显著差异。且该菌株抑菌谱较广,除核盘菌外,对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum等其他9种病原真菌均有抑制作用。本研究获得的4AP1菌株对核盘菌具有较强抑制作用,且耐热耐强碱环境,为构建杀虫抗病Bt工程菌提供了菌株资源。

Bt菌株对小猿叶甲的活性筛选

筛选了 2 9种苏云金杆菌菌株对小猿叶甲幼虫的活性。结果表明 ,在 0 .0 5显著水平 ,有 1 2种苏云金杆菌菌株对小猿叶甲幼虫表现出不同程度的杀虫活性。

海南省热带农业资源研究所从广西大王岭自然保护区土样中分离出Bt菌株克隆出—Bt Cry 30Ea1新基因

最近,海南省热带农业资源开发利用研究所在微生物科研的研究工作方面取得了突破性进展。在所长方宣钧博士及其张文飞博士、谢柳硕士生的共同努力下,从广西省大王岭自然保护区的土样中分离出一株高产圆形杀虫晶体蛋白的Bt菌株20070720S2160—1，

柳杉毛虫幼虫高致病力Bt菌株筛选研究

采用9株不同Bt菌株侵染柳杉毛虫4龄幼虫,依据其形态、行为和死亡率等指标,筛选出高致病力菌株;在此基础上,进一步测定幼虫在感染高致病力菌株后不同时间阶段的总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性变化趋势,初步探析柳杉毛虫幼虫被侵染后的生理应激机制。结果表明:(1)供试的9株Bt菌株中,HQ47菌株致病力最强,在侵染试验中校正死亡率达100%,致死中时为3.62 d;(2)柳杉毛虫幼虫被HQ47菌株侵染的72 h内,体内T-SOD、CAT和GST活性总体上均高于对照组,其中,T-SOD呈现先激活后抑制的变化趋势,CAT和GST则呈现激活-抑制-再激活-再抑制的变化趋势,3种酶活性均在侵染后的36 h达到最大值,分别为532.92 U·mgprot^(-1)、51.10 U·mgprot^(-1)、167.44 U·mgprot^(-1),并显著高于对照组(P<0.05)。筛选出的Bt菌株为柳杉毛虫的生物防治提供了可应用的菌株资源。

抗光肩星天牛苏云金芽胞杆菌Bt886菌株的分离及对毒蛋白编码基因的初步鉴定

从拟谷盗虫尸中分离到一株对鞘翅目害虫光肩星天牛幼虫毒杀作用明显的Bt菌株Bt886。幼虫死亡率高达 6 0 % ,存活者生长明显受到抑制。经过晶体形态特征和杀虫谱分析 ,初步确认该菌株属于cry3类。比较cry3类基因的保守序列 ,利用一对cry3特异引物成功地从Bt886菌株中克隆到了一段基因片段并克隆至pGEM -T载体上。测序分析发现该片段与cry3Aa1基因具有很高的同源性 ,确定来自毒蛋白编码基因。Southern杂交分析表明该基因位于该菌株的质粒上。

微生物杀虫剂Bt53菌株的发酵培养基优化

运用正交试验L2 7(313 )设计法对鳞翅目昆虫高毒效的苏云金杆菌Bt5 3菌株进行培养基优化试验 ,在培养温度 30± 1℃ ,5 0ml/5 0 0ml三角瓶 ,摇床转速 180r/min条件下 ,苏云金杆菌 5 3菌株的发酵最佳培养基是 (% ) :碳源 0 5、氮源A 2 0、氮源B 0 10、氮源C 0 2 5、磷酸氢二钾 0 75、碳酸钙 0 15、硫酸镁 0 0 18及pH8 0。

初始接种量对Bt33菌株孢子含量的影响

在温度 30± 0 5℃、转速 180r/min的条件下 ,用Bt发酵培养液对Bt33菌株进行振荡培养 ,考察不同接种量和液培时间对孢子含量的影响。结果表明 ,将孢子含量为 2 5× 10 9CFU ml的母液按 1%～ 15 % (V V)的比例接种后培养 33～ 5 0h ,9%和 12 %接种量处理能产生 8 5× 10 9CFU ml以上的孢子浓度。通过拟合逻辑斯蒂生长模型 ,发现该菌在上述液培条件下的最大孢子含量为 1 0 3× 10 1 0 CFU ml。

苏云金杆菌Bt S387菌株防治水稻纵卷叶螟试验

利用经化学诱变剂硫酸二乙酯 (DES)连续多次诱变所获苏云金杆菌BtS387菌株工业发酵制剂 ,在水稻纵卷叶螟二代、三代卵孵高峰期分别喷施 375 0mL·hm-2 ,8d ,保叶率和杀虫率分别达 77.89% ,87.34%和 6 4 .94 % ,82 .6 4 % ,同时 Bt制剂不污染环境 ,有实际应用价值。

海南省热带农业资源研究所从菌株Bt20070720S2160-1中克隆Cry 40D基因家族新成员—Bt Cry 40Da1基因

最近,海南省热带农业资源开发利用研究所在微生物科研工作方面又有新的突破性进展。在所长方宣钧博士及其张文飞博士的共同努力下,从广西省大王岭自然保护区的土样中分离出一株Bt菌株20070720S2096-2,

海南省热带农业资源研究所从菌株Bt W015中克隆Cry 1Ac基因家族新成员——Bt Cry 1AC22基因

最近,海南省热带农业资源开发利用研究所在Bt项目的研究工作方面取得了突破性进展。所长方宣钧博士及其博士研究生张文飞,在病死幼虫中分离出一株高产菱形杀虫晶体蛋白的Bt菌株W015,通过PCR-RFLP方法鉴定该菌株含有Cry1Ac基因,

来自海南等地的17个Bt分离株质粒多样性分析

本研究采用琼脂糖凝胶电泳对分离自海南岛的12个Bt菌株与分离自广西、黑龙江的5株Bt菌株及2株Bt模式菌株进行质粒数量、大小等特征分析。19个供试菌株可区分为16种独特的质粒电泳图谱,充分显示出不同来源Bt菌株的质粒多样性。进一步选择了其中的10个菌株,利用包埋法制备琼脂块进行脉冲场凝胶电泳(PFGE),结果表明苏云金芽孢杆菌大质粒组成特征也具有丰富多样性。但是供试菌株的质粒电泳图谱并未体现与地理和生态特征相关联的特征差异。研究结果初步证实海南分离株S3078-1是一株无内生质粒的Bt菌株,而S3031-1和S3073-1两个分离株仅有一个大质粒存在,这三个分离株将为进一步研究质粒功能提供初始菌株。本研究进一步暗示将琼脂糖凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳结合起来研究质粒特征提高了结果的可靠性。

Bt毒素蛋白基因的PCR鉴定及定位

利用合成的cryI、cryIII和cryV基因专一性引物 ,检测了从土壤中分离到的 56株苏云金芽孢杆菌菌株所含的晶体毒素蛋白基因。含有cryI基因的有 7株 ,含有cryIII基因的有 2株 ,同时含有cryI和cryV基因的有 2 1株。斑点杂交及Southern杂交分析表明 ,cryV基因定位于 1 50MD的大质粒上。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的研究

根据已知vip3A基因序列设计一对特异性引物VIP3／VIP5，对218株Bt菌株进行PCR鉴定，有51株含有vip3A类基因，其中12株为不同亚种的标准菌株，有4株标准菌株不含有该基因。从Bt C9菌株中分离克隆了vip—C9基因，并插入表达载体pET—21b，转化大肠杆菌BL21，诱导表达出分子量88．6kDa的可溶性蛋白，表达产物对甜菜夜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性，LC50分别为0．42ng／mg和25．95ng／mg，对小菜蛾活性较低。构建了缺失蛋白Vip—C9—N(N端去除39个氨基酸组成的信号肽序列)，杀虫活性测定结果表明其对甜菜夜蛾的活性显著降低，说明N端39个氨基酸对甜菜夜蛾的活性是必需的。

上海地区苏云金芽孢杆菌的分离及其对草地贪夜蛾室内杀虫活性的测定

为进一步发掘国内苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的菌株资源,在上海市若干地区搜集土壤样品,采用NaAc-抗生素筛选法从土样中分离野生Bt菌株,通过光学显微镜染色镜检、PCR-RFLP体系及SDS-PAGE电泳等方法对分离菌株的杀虫晶体蛋白形态、蛋白表达量及cry基因类型进行分析,并测定了分离菌株对草地贪夜蛾的室内杀虫活性。结果表明:在上海地区采集的165份土壤样品中共分离得到苏云金芽孢杆菌50株,总出菌率为8.20%;其伴孢晶体蛋白呈菱形、球形、椭球形、不规则形等晶体形态,以球形晶体为主;多数表达130 ku、90 ku、80 ku、50 ku蛋白;分离菌株所含cry基因类型丰富,包含cry1、cry3、cry8类等共16种基因类型,以cry32及cry8类基因居多;有6株菌株对草地贪夜蛾表现出高杀虫活性,72 h校正死亡率最高可达100%。上述分离菌株对后续开展草地贪夜蛾的绿色防控及抗性治理具有重要的实践意义。

印度批准地方性的开发生物农药

一种商品名称为Knock（Bacillus thuringiensis Var Kurstaki）用于防治油料种子作物害虫如蓖麻籽上的鳞翅目类害虫的生物杀虫剂获得印度油料种子研究理事会（DOR）的批准。该理事会说它是第1个被批准作商业应用的地方开发的微生物农药。该研究集团也为Bt的低成本和批量生产开发了新技术。它能提供可供销售的生产和制剂技术。Bt菌株和为非专业登记所需资料的费用共需20万卢比（折合4376美元）。此技术可为缺少资源的农户带来Bt产品。