过表达白细胞介素8促进乳腺癌BT549细胞迁移

目的构建含有白细胞介素8(IL-8)基因的重组腺病毒,并观察其对BT549乳腺癌细胞增殖、细胞周期以及迁移能力的影响。方法以143B细胞c DNA为模版,PCR扩增IL-8基因,与穿梭质粒p Ad Track-TO4连接,构建重组穿梭质粒p Ad Track-TO4-IL-8,由PmeⅠ线性化并电转入Ad Easier细菌中,获得重组腺病毒质粒p Ad IL-8,PacⅠ酶切经LipofectamineTM2000介导转入HEK293细胞进行包装扩增,检测滴度;反转录PCR检测BT549细胞中IL-8 mRNA的水平,ELISA检测BT549细胞培养上清液中IL-8的水平;流式细胞术检测细胞周期情况;MTT法检测细胞增殖能力;划痕愈合实验检测细胞迁移能力。结果PCR以及测序证实p Ad Track-TO4-IL-8构建成功;p Ad IL-8经酶切证实重组正确;重组腺病毒Ad IL-8感染BT549细胞,可高表达IL-8。过表达IL-8的BT549细胞迁移能力增强,但其增殖活性无明显变化、将细胞周期阻滞于S期。结论过表达IL-8可促进BT549细胞的迁移。

稳定干扰ITGB1抑制人乳腺癌BT549细胞迁移和侵袭

在人乳腺癌细胞系BT549中稳定干扰整合素β1(integrinβ1,ITGB1),研究其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。构建靶向干扰ITGB1基因的sh RNA慢病毒,感染BT549细胞,通过筛选成功获得稳定干扰ITGB1蛋白的BT-549细胞系,实验设空白对照组(Blank)、病毒感染阴性对照组(shNC)、ITGB1-shRNA慢病毒感染组(shITGB1);Real-time PCR和Western blotting法检测稳定干扰后ITGB1 mRNA和蛋白的表达情况;Western blotting法检测稳定干扰ITGB1后上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志蛋白(E-cadherin,Vimentin,N-cadherin,Fibronectin)的表达情况;利用划痕试实验和Transwell侵袭试实验分别检测稳定干扰ITGB1后细胞的迁移及侵袭能力。Real-time PCR和Western blotting结果显示,shITGB1组细胞ITGB1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于Blank组和shNC组细胞(p<0.01,p<0.01)。Western blotting结果显示,稳定干扰ITGB1可部分逆转乳腺癌细胞BT549的EMT化;稳定干扰ITGB1后,上皮标志蛋白E-cadherin表达显著上调(p<0.01),间质标志蛋白Vimentin(p<0.05)、N-cadherin(p<0.01)和Fibronectin(p<0.01)的表达显著降低。划痕和Transwell侵袭试验实验结果显示,稳定干扰ITGB1后可显著降低乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力(p<0.05,p<0.05)。在乳腺癌BT549细胞中稳定干扰ITGB1后,通过逆转EMT化抑制细胞迁移和侵袭。

阳和汤对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的观察阳和汤对人三阴性乳腺癌细胞BT549凋亡及STAT1/p53信号通路的影响,探讨其抑制三阴性乳腺癌发展的可能机制。方法将BT549细胞分为空白对照组、阳性药组及阳和汤低、中、高剂量组,分别用灌胃蒸馏水、5-氟尿嘧啶及阳和汤低、中、高浓度药液后的血清进行干预,DAPI染色和流式细胞术检测细胞周期及凋亡,q RT-PCR检测细胞信号传导和转录激活因子(STAT)1、p53 mRNA表达,Western blot检测STAT1/p53信号通路相关蛋白STAT1、STAT3、p53及Bax蛋白表达。结果与空白对照组比较,阳和汤低、中、高剂量组细胞凋亡率明显升高(P<0.01),G0/G1期细胞比例增加,G2/M期细胞比例降低(P<0.05,P<0.01),阳和汤高剂量组细胞STAT1、p53 mRNA表达明显升高(P<0.01),阳和汤中、高剂量组细胞STAT1、p53、Bax蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01),阳和汤低、中、高剂量组细胞STAT3蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论阳和汤能诱导BT549细胞凋亡,其机制与调控STAT1/p53信号通路相关因子STAT1、STAT3、p53和Bax表达有关。

酸性亮氨酸核磷酸蛋白32B促肿瘤机制的体外研究

目的:探讨酸性亮氨酸核磷酸蛋白32B(acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32B,ANP32B)促进肿瘤发生、发展的分子机制,为其可能作为治疗靶点提供理论依据。方法:利用免疫沉淀联合质谱技术寻找和验证ANP32B相互作用蛋白;免疫荧光技术检测ANP32B和核浆转运蛋白α6(karyopherinα6,KPNA6)在细胞内的定位;采用短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)沉默KPNA6的表达;行GST-pulldown实验明确ANP32B与KPNA6直接结合及相互作用的区域。结果:通过免疫沉淀和质谱鉴定发现,ANP32B与KPNA6间存在相互作用,两者的结合不依赖ANP32B N端1~161氨基酸序列。体外GST-pulldown实验证实,KPNA6与ANP32B间存在直接的相互作用,且两者结合依赖ANP32B的核定位信号。利用sh RNA抑制KPNA6的表达后,并不影响ANP32B的核内定位。结论:ANP32B通过核定位信号序列与KPNA6结合,两者在细胞核中有明显的共定位,而敲除KPNA6并不影响ANP32B的核内定位。