BVDV基因E_0在人参发根的转化及其分子检测

将重组鹿源BVDV基因E0植物表达载体(pBI121/E0),通过发根农杆菌Ri介导,用叶盘法转化得到人参发根,分别用PCR、RT-PCR检测其转化情况。结果表明:获得了转鹿源BVDV基因E0人参发根,鹿源BVDV基因E0已整合到人参发根基因组中并得到了转录,为研制转基因人参发根疫苗提供了科学依据和材料。

青海牦牛BVDV E0基因的表达与抗原性检测

将青海牦牛病毒性腹泻病毒(BVDV)QHZK株的E0基因亚克隆入原核表达载体pET-32(α),构建了重组表达载体pET-32(α)-E0,然后用重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,并利用IPTG诱导蛋白表达。表达的蛋白用His-Band镍柱进行亲合层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果显示,E0基因可在大肠杆菌中获得表达,表达产物的分子质量约为44ku,与预计的蛋白分子质量大小一致。Western-blot分析表明,该蛋白可以与BVDV标准阳性血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性,为BVDV亚单位疫苗的研究奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒牦牛分离株E0基因的克隆表达

将青海牦牛牛病毒性腹泻病毒(BVDV)青海泽库(QHZK)株的E0基因亚克隆入原核表达载体pET-32(a),构建了重组表达载体pET-32(a)-E0,然后用重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,并利用IPTG诱导蛋白表达。表达的蛋白用His-Band镍柱进行亲合层析纯化,Western blot鉴定表达蛋白。结果显示,E0基因可在大肠埃希菌中获得表达,表达产物的分子质量约为44ku,与预期的蛋白分子质量大小一致;Western blot分析表明,该蛋白可以与BVDV标准阳性血清产生特异性结合反应。

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a(+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库构建与筛选

旨在获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性纳米抗体。通过用BVDV-E0重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞。利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与BVDV-E0蛋白结合的噬菌体,对所得VHH序列进行测序和基因比对。用ELISA筛选出抗BVDV-E0的高亲和力纳米抗体,并验证纳米抗体的亲和力和活性。结果成功构建了插入率为86%、库容量为1.3×1011 cfu的噬菌体表达文库,经过筛选获得5个BVDV-E0阳性单克隆,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的BVDV-E0纳米抗体,经亲和力的鉴定获得2个不同的高亲和力的VHH基因,并且能结合人工抗原E0,还能够被竞争抗体所阻断。研究结果为用于组装检测BVDV试剂盒和研制BVDV疫苗奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒多表位基因疫苗的构建及其免疫效果评价

旨在构建牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)多表位基因与BVDV结构蛋白E0、E2基因的表达载体并检测其免疫效果。从NCBI上获得BVDV的4种具有免疫原性的结构蛋白C、E0、E2、NS3基因序列,利用生物学方法预测其B、T细胞表位;将获得的序列进行连接,重组获得新肽段(命名为AKK),通过生物学在线软件分析AKK序列的二级结构、亲水性、抗原性、三级结构;PCR分别扩增上述基因序列,构建重组表达载体GV658-AKK-E0-E2、GV658-AKK、GV658-E0、GV658-E2,并将上述构建成功的无内毒素重组质粒转染至MDBK细胞,通过蛋白免疫印迹。经PCR扩增获得2910、1170、951和729 bp大小的目的条带,与预计相符;经蛋白免疫印迹验证,在34和68 kDa处有AKK蛋白及E0-E2蛋白的融合表达;经流式细胞术验证显示,在CD3^(+)、CD4^(+)细胞占比上,共表达组极显著高于PBS组,显著高于E0组,与ELISA检测IgG抗体水平结果一致。研究表明,试验成功设计了BVDV多表位序列AKK,并成功构建真核表达载体,AKK、E0、E2蛋白高效表达,共表达组能更好地刺激机体的体液免疫和细胞免疫应答。

牛病毒性腹泻病毒E0和E2蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠埃希菌中融合表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E0和E2基因,并进行纯化。方法采用RT-PCR法分别扩增BVDV BA株的E0和E2基因片段,通过酶切位点将二者串联并克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-E0-E2,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白E0-E2经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot分析。结果重组表达质粒pET-28a-E0-E2经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白E0-E2相对分子质量约为68 500,表达量约占菌体总蛋白的20%,主要以包涵体形式存在;纯化的融合蛋白纯度达95%,可与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应。结论在大肠埃希菌中融合表达了BVDV E0和E2蛋白,纯化后的融合蛋白纯度较高,为BVDV抗体ELISA检测方法的建立及新型疫苗的研制奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0的构建与免疫原性分析

利用SacⅠ、HindⅢ限制性内切酶分别对pMG36e与pMD19-T-E0进行双酶切,将目的基因E0整合入穿梭表达载体pMG36e,构建牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0。提取重组质粒pMG36e-E0,进行双酶切鉴定及PCR鉴定。将阳性重组质粒pMG36e-E0转化到大肠杆菌DH5α中进行表达,对表达产物进行SDSPAGE和Western-blotting鉴定。用表达的E0蛋白二次免疫家兔,间接ELISA法检测其血清抗体水平。结果,重组质粒经双酶切得到大小分别约为3 600、691bp的2个片段,PCR扩增出691bp的片段,双酶切与PCR鉴定结果表明目的基因E0正确插入到载体pMG36e中。SDS-PAGE电泳结果表明E0基因在大肠杆菌获得了表达,表达产物相对分子质量大小约为27 000。Western-blotting分析结果证明表达产物能被BVDV阳性血清所识别。ELISA检测结果证明表达的E0融合蛋白能刺激动物产生抗体,具有天然蛋白的免疫原性。

牛病毒性腹泻病毒JL-1株E0基因的序列分析及其原核表达

为研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因序列的保守性及其表达蛋白的抗原性,采用高保真酶从牛病毒性腹泻病毒JL-1株中扩增出完整的E0基因,将其测序结果与GenBank中公布的13株BVDV 1型和2株BVDV 2型的E0基因序列进行同源性比较并绘制系统进化树。将JL-1株E0基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中以构建原核表达重组质粒pGEX-6P-E0,并转化至表达宿主菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,JL-1株E0基因与13株BVDV 1型的E0基因具有较高的同源性,介于75.3%~94.0%之间,而与2株BVDV 2型的E0基因序列的同源性较低。原核表达获得可溶性的E0融合蛋白大小约为50ku。Western-blot分析结果显示,目的蛋白具有良好的反应原性。结果证实,牛病毒性腹泻病毒E0基因具有较高的保守性,其表达的蛋白具有较好的反应原性。

黑龙江省部分地区进口荷斯坦奶牛病毒性腹泻血清流行病学调查

为了解黑龙江省进口荷斯坦奶牛感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的情况,试验采用原核表达蛋白E0-E2为抗原,建立间接ELISA法,检测奶牛血清中BVDV的抗体。结果表明:九三地区的BVDV抗体阳性率最高,达到了72.22%;密山地区阳性率最低,但也达到了59.91%;北安地区阳性率为61.84%,总体血清阳性率为64.35%。说明病毒性腹泻在黑龙江省存在非常高的血清阳性率,提示必须加强对本病的检疫净化,采用间接ELISA法对不同牛群进行BVDV抗体检测,可以及时了解病毒性腹泻的感染清况,为防治该病提供理论依据。

BVDV-1 VLPs的构建及免疫原性研究

目的利用C、E0、E1和E2蛋白构建BVDV病毒样颗粒,并评价BVDV-1 VLPs的免疫原性。方法以BVDV-BA株为模板通过反转录得到C、E0、E1和E2基因,再将C、E0、E1和E2基因分别克隆至PEASY-Blunt Simple克隆载体上。提取质粒摇菌扩大培养,将得到的C、E0、E1和E2基因克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Bac HTA中,采用热激法将重组穿梭质粒转化至DH10.Bac大肠埃希菌感受态细胞,通过蓝白斑筛选技术获得重组杆粒rB-C、rB-E0、rB-E1和rB-E2。将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒;再用构建的4种重组杆状病毒同时感染SF9悬浮细胞,72 h后收集细胞沉淀进行超声破碎,利用蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心进行纯化,通过Western blot和透射电镜进行鉴定。将获得的BVDV-1 VLPs联合氢氧化铝佐剂免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体水平评价VLPs的免疫原性。结果成功克隆出C、E0、E1和E2基因,并构建C、E0、E1和E2蛋白的杆状病毒。通过纯化和鉴定,在20%~30%蔗糖层获得由C、E0、E1和E2蛋白组成结构完整的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。BVDV-1 VLPs能够显著增加免疫小鼠的特异性抗体表达水平。结论构建并获得了由C、E0、E1和E2蛋白组成,并具备良好免疫原性的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。