活体烟草BY-2悬浮细胞微丝骨架的标记

微丝骨架是细胞骨架的重要成员,在细胞的多项生理活动中发挥着重要作用.本论文利用荧光标记鬼笔环肽技术和GFP融合蛋白技术,对活体烟草BY-2悬浮细胞中微丝骨架的标记方法进行了探索,结果表明,10nmol/L的Alexa488-Phalloidin为细胞微丝骨架标记的最佳浓度,利用PCR等技术构建pPZP-NtFABD2-GFP植物表达载体后,转化烟草BY-2悬浮细胞,激光共聚焦扫描显微镜观察发现,NtFABD2-GFP融合蛋白能够清晰地显示活体烟草悬浮细胞内的微丝骨架.这些结果为进一步深入研究微丝骨架在活体植物细胞中的功能奠定了基础.

烟草赤星病菌代谢产物诱导的烟草BY-2细胞ROS爆发和ATP损耗

【目的】探讨赤星病菌代谢产物(metabolic products of Alternaria alternata,MP)对烟草BY-2细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生和ATP含量的影响以及产生这种影响的原因。【方法】用10%MP处理烟草BY-2细胞,用氧电极检测不同MP处理时间后,烟草BY-2细胞呼吸速率和呼吸途径的变化,同时分析BY-2细胞内H2O2产生和ATP含量等的变化。【结果】MP处理导致了烟草BY-2细胞H2O2爆发和ATP含量下降,此外,MP处理也导致了烟草BY-2细胞总呼吸速率、细胞色素途径(cytochrome pathway)和交替氧化酶途径(AOX)的下降,并且造成线粒体通透转换孔道(permeability transition pore,PTP)开放和细胞色素c释放。【结论】MP对BY-2细胞呼吸速率和细胞色素途径的抑制不可避免地导致胞内ATP含量下降,此外MP诱导的烟草BY-2细胞氧化磷酸化的解偶联作用是MP导致胞内ATP含量下降的另一重要原因。而MP对AOX途径的抑制则是诱导胞内ROS爆发的重要原因。

H_2O_2诱导烟草悬浮细胞的凋亡

烟草悬浮细胞经不同浓度的过氧化氢处理发现 ,当用 6mmol L的H2 O2 处理时从形态学上可观察到明显的染色质凝聚 ,细胞质皱缩和细胞核解体等现象 ;DNA电泳结果显示发生凋亡的细胞基因组DNA被降解形成明显的DNA梯状条带 ,从而表现出典型的细胞凋亡特征 .其他高浓度的处理也有以上特征 ,但细胞坏死数目也相对增多 ,因此本研究认为 6mmol L的H2 O2 处理 2 4h能够非常有效地诱导烟草悬浮细胞的凋亡 .

NADPH氧化酶NtrbohD参与烟草悬浮细胞ABA诱导的H_2O_2快速产生过程

研究了烟草BY-2悬浮细胞在脱落酸(ABA)诱导下产生过氧化氢(H2O2)的机制,发现ABA能够显著诱导H2O2快速产生,且H2O2主要是由超氧化物歧化酶催化超氧阴离子产生的.ABA处理可导致烟草悬浮细胞质膜NADPH氧化酶活性以时间依赖的方式快速增加,其增加的幅度和时间与ABA诱导H2O2积累一致,而且,这些增加的效应能够被NADPH氧化酶抑制剂碘二苯和咪唑显著抑制,说明质膜NADPH氧化酶参与烟草悬浮细胞H2O2快速积累过程.另外,用RT-PCR和蛋白印迹技术分析了烟草质膜NADPH氧化酶基因NtrbohD的表达水平,发现该基因在mRNA和蛋白水平的表达受ABA上调,表明NtrbohD参与烟草悬浮细胞ABA诱导H2O2快速产生过程.结果说明,ABA能够诱导悬浮细胞通过NADPH氧化酶快速产生活性氧,提示NAD-PH氧化酶和H2O2可能是植物细胞中ABA信号转导途径的重要成分.

烟草BY-2细胞生长和呼吸对不同类型酸雨的响应

为了直观探究不同类型酸雨对植物生理生长的影响,以烟草Bright Yellow-2(BY-2)细胞为试验材料,模拟不同p H值(1.5、2.5、3.5、4.5、5.5)下硫酸型酸雨(SAR)、硝酸型酸雨(NAR)及混合型酸雨(MAR),以期了解其对烟草BY-2细胞干重和呼吸的影响。研究表明,在不同酸度下,烟草细胞干重均低于对照,细胞呼吸出现紊乱变化,说明不同p H下的酸雨对细胞均有伤害,BY-2细胞的干重和呼吸有不良反馈,且不同酸度的伤害程度不一,强酸(p H值为1.5)下对细胞迫害性最强。因此,不同类型酸雨对植物有迫害性,迫害性大小为SAR>NAR>MAR。

烟草悬浮细胞在凋亡过程中Ca^(2+)分布的共聚焦显微成像研究

以Fluo-3AM为游离Ca^(2+)荧光探针,利用激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)对烟草悬浮细胞在热激诱导的凋亡过程中Ca^(2+)时空分布进行了研究。结果显示,在正常细胞中,Ca^(2+)集中分布在细胞壁和细胞核中,细胞质中分布较少;在凋亡早期细胞中,细胞质中Ca^(2+)的浓度增加;在凋亡晚期的细胞中,细胞核中的Ca^(2+)浓度增加较为明显。结果提示,在凋亡过程中,Ca^(2+)的定位分布存在一定的规律。

烟草悬浮细胞抗氧化系统对微囊藻毒素-RR的响应

采用0.1mg/L的微囊藻毒素-RR(MC-RR)处理烟草BY-2悬浮细胞,测定了细胞活力、细胞内活性氧(ROS)及抗氧化系统的变化.结果表明,处理144h后,BY-2的细胞活力与对照相比无显著差异,但是处理细胞的ROS含量随着MC-RR处理时间的延长而迅速上升,96h后,细胞的ROS含量与对照差异显著;毒素处理细胞的过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性明显升高,分别在处理48h和72h后与对照差异显著;细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)含量有一个先下降后升高的过程,96h后,MC-RR处理的细胞中GSH含量显著高于对照;然而,0.1mg/L的MC-RR处理144h后,过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性与对照相比没有显著差异.恢复处理168h后,抗氧化系统各个指标均恢复到对照水平.

逆境诱导烟草悬浮细胞内处理小体的形成

指出处理小体(processing body,P-body)在真核细胞基因表达调节过程中,特别是在逆境条件下,能为mRNA在细胞质内转运提供储存和降解场所.研究通过农杆菌转化法成功将含有处理小体荧光标记物-脱帽酶1(decapping enzyme,DCP1)与青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)融合蛋白基因的植物表达载体转入烟草悬浮细胞.利用激光共聚焦显微镜观察到在高温和盐胁迫下,处理小体的数量和体积都有增加.通过蔗糖密度梯度离心分析逆境条件下多核糖体的变化,发现在高温和盐胁迫下,多核糖体解体,呈现翻译抑制特征.

NaCl胁迫下交替呼吸途径对烟草悬浮细胞死亡调节作用的研究

盐分胁迫是植物在自然环境中经常遭遇的环境胁迫因素之一,会引起植物代谢紊乱乃至细胞死亡,这严重限制了植物的生长、繁育和生存。交替呼吸途径是植物较之动物独特的线粒体呼吸途径。该研究在烟草悬浮细胞中调查了交替呼吸途径对Na Cl胁迫引起的植物细胞死亡过程的调节作用及相应的内在机制,以及在200 mmol·L^(-1)Na Cl处理的烟草悬浮细胞中研究了交替呼吸途径和细胞死亡发生及H_2O_2之间的关系。结果表明:(1)随着Na Cl处理浓度的增加,烟草悬浮细胞死亡水平逐渐增加,而交替呼吸途径的容量也逐渐上升。(2)与Na Cl处理相似,外源H_2O_2的处理也能导致烟草悬浮细胞死亡水平的增加。200 mmol·L^(-1)Na Cl的胁迫导致明显的细胞死亡发生和H_2O_2产量的显著性增加;而较之200 mmol·L^(-1)Na Cl胁迫下的细胞,用水杨基氧肟酸(交替呼吸途径的抑制剂)预处理后的细胞再置于200 mmol·L^(-1)Na Cl的胁迫下导致更高水平的细胞死亡和H_2O_2的产生。综上表明,高盐胁迫诱导了烟草悬浮细胞的交替呼吸途径的增加,而交替呼吸途径则可能通过抑制活性氧的产生而起到缓解细胞死亡发生的作用。

机械刺激诱导的烟草悬浮培养细胞耐热性及其与过氧化氢的关系

机械刺激可诱发烟草悬浮培养细胞中H_2O_2的积累,提高烟草悬浮培养细胞在高温胁迫下的存活率和再生能力,缓解高温胁迫下的细胞活力丧失和膜伤害,外源H_2O_2预处理也可提高烟草悬浮细胞的耐热性。这些暗示H_2O_2作为信号分子可触发机械刺激诱导的烟草悬浮细胞耐热性形成。

烟草悬浮系培养与细胞器的分离

通过诱导BY-2型烟草叶片愈伤组织,进一步建立烟草细胞悬浮系.酶解去壁从细胞悬浮系中获得原生质体,用含有0.5%Triton X-100的CSK缓冲液破裂细胞膜,释放出细胞器.再通过不连续的蔗糖-Percoll梯度进行速率区带离心,分离纯化出细胞核和叶绿体.通过分离、纯化细胞核的对照实验证明不同培养条件对烟草细胞悬浮系的生长和周期具有显著影响.

外源抗坏血酸对烟草细胞生长及衰老的影响

用不同浓度的外源抗坏血酸(ASA)对BY-2烟草悬浮细胞进行处理,测定了细胞中可溶性蛋白质含量、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量、相对电解质渗透率、超氧化物歧化酶(SOD)活性、抗坏血酸(ASA)含量和还原型谷胱甘肽(GSH)含量等生理生化指标,从细胞脂质过氧化及抗氧化功能的角度探讨了不同浓度抗坏血酸对BY-2烟草悬浮细胞生长及衰老的影响。结果表明,当用2mmol.L-1 ASA处理时,能促进细胞分裂生长,增加可溶性蛋白产量,减少膜透性和MDA含量,维持SOD活性和ASA与GSH含量在较高水平,说明ASA对促进细胞生长,维持细胞抗氧化功能以延缓细胞衰老方面起着重要作用。但当ASA浓度过高,超出4mmol.L-1时则对细胞造成伤害,MDA含量和膜透性增加,SOD活性降低,ASA和GSH含量呈现先升后降的趋势。

微囊藻毒素-RR对烟草细胞活力及营养生理的影响

采用0.1,1.0,10.0μg/mL的微囊藻毒素-RR(MC-RR)处理烟草BY-2悬浮细胞,测定了细胞活力、细胞内蛋白质含量、可溶性糖含量、硝态氮含量及总磷含量,并且检测了酸性磷酸酶(ACP)的活力变化情况.结果表明,中、高浓度毒素处理细胞2d后,细胞活力及蛋白质含量与对照相比均显著下降.高浓度MC-RR处理降低了胞内可溶性糖的含量,暴露2d后仅为对照的45.57%;低浓度MC-RR处理在后期增加了胞内可溶性糖含量.高浓度毒素处理细胞4d后,细胞内硝态氮含量显著低于对照;中、低浓度毒素处理细胞7d后降低了胞内硝态氮含量.3组毒素处理均降低了胞内总磷含量,到实验结束时,低、中、高浓度处理组的胞内磷含量分别为对照的74.98%、76.47%和84.00%.3组处理组ACP活力与对照相比呈现先降低后升高的趋势.

烟草丝束蛋白ABD2与微丝的体内体外相互作用

微丝骨架在细胞的生命活动中具有重要的功能,而其动态的解聚聚合特性是其实现功能的前提.丝束蛋白(fimbrin/plastin)做为微丝结合蛋白质,是微丝骨架的重要调控因子之一,含有2个肌动蛋白结合结构域,目前对其结合微丝的机制并不清楚.本文以烟草丝束蛋白的肌动蛋白结合结构域2(NtFAbd2)为研究对象,通过原核细胞表达纯化NtFAbd2,利用体外沉淀法分析发现,NtFAbd2能够与微丝结合;利用激光共聚焦扫描显微镜分析发现,在烟草BY-2悬浮细胞内,NtAbd2-GFP与微丝共分布,这些结果为深入分析植物丝束蛋白的作用机制提供了新的数据.

CuCl_2胁迫对烟草BY-2悬浮细胞死亡的诱导

本文以不含叶绿体的烟草BY-2悬浮细胞系为实验材料,研究了CuCl2胁迫对BY-2细胞呼吸速率、呼吸途径以及细胞内H2O2和ATP含量的影响。结果表明:0.5mmol·L-1CuCl2胁迫明显导致了烟草BY-2细胞的死亡,引起了胞内H2O2爆发和ATP含量下降,严重抑制了BY-2细胞的总呼吸和交替氧化酶途径(alternative oxidase pathway,AOX)。此外,CuCl2对BY-2细胞的线粒体电子传递具有即时的抑制作用。加入外源腺苷(ATP合成的底物)显著抑制了CuCl2胁迫引起的ATP损耗,并阻止了细胞死亡。上述结果表明CuCl2胁迫导致的ATP损耗在CuCl2诱导烟草BY-2细胞死亡过程中起重要的作用。

嘧肽霉素诱导烟草BY-2悬浮细胞防卫反应的研究

[目的]利用烟草BY-2悬浮细胞研究抗病毒新农药2%嘧肽霉素水剂诱导植物防卫反应的机制。[方法]用不同质量浓度的嘧肽霉素处理悬浮细胞,分光光度法测定胞外H2O2产生的动态过程及RT-q PCR方法测定防卫反应基因表达。[结果]烟草BY-2悬浮细胞经嘧肽霉素处理,产生活性氧迸发,并在处理1 h后达到高峰;嘧肽霉素能诱导细胞的FLS2、MAPKKK、PR1、NPR1和HSP70的上调表达,其中HSP70的上调效果最为显著。[结论]嘧肽霉素可通过诱导植物防卫反应相关基因的表达,达到诱导植物抗病毒病的作用。

Cd^(2＋)胁迫诱导烟草悬浮细胞脯氨酸积累的生化途径及外源脯氨酸对Cd^(2＋)胁迫下H_2O_2产生的抑制作用

Cd^(2+)可提高烟草悬浮细胞脯氨酸的含量,顺序上调脯氨酸合成关键酶鸟氨酸转氨酶(OAT)、精氨酸酶、△~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和谷氨酸脱氢酶(GDH)的活性,降低脯氨酸降解关键酶脯氨酸脱氢酶(ProDH)的活性,表明Cd^(2+)胁迫诱导烟草细胞脯氨酸的积累是脯氨酸合成的鸟氨酸途径和谷氨酸途径顺序激活、而脯氨酸降解途径显著抑制的综合结果。此外,Cd^(2+)能导致烟草细胞H_2O_2的快速产生及H_2O_2产生相关酶(质膜NADPH氧化酶、细胞壁多胺氧化酶及共价结合与离子结合细胞壁过氧化物酶)活性升高和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)增加,导致烟草细胞的氧化胁迫。外源脯氨酸预处理显著抑制了Cd^(2+)诱导的烟草细胞H_2O_2的产生与MDA的增加,减轻了Cd^(2+)诱导的氧化胁迫。而脯氨酸抑制Cd^(2+)诱导的H_2O_2产生可能是由于脯氨酸抑制了H_2O_2产生相关酶的活性所致。

钙信使系统对机械刺激诱导的烟草悬浮培养细胞中H_2O_2爆发的调控

机械刺激可诱导烟草悬浮培养细胞H2O2的爆发,外源Ca2+有强化作用,而Ca2+螯合剂EGTA、质膜Ca2+通道阻塞剂La3+、胞内Ca2+通道阻断剂钌红,以及钙调素拮抗剂氯丙嗪和三氟拉嗪则削弱机械刺激诱导的氧化爆发。这暗示以钙和钙调素为核心的钙信使系统对机械刺激诱发的烟草悬浮培养细胞中H2O2的爆发有调控作用。

烟草NtCDC48基因的克隆及功能分析

利用裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)系统从烟草BY-2悬浮细胞中分离得到了NtCDC48 cDNA序列,全长2729bp,包括74bp的5′端非翻译区,2427bp的开放阅读框以及228bp的3′端非翻译区,可读框编码808个氨基酸,推导蛋白含有两个典型的ATPase模块(aa：245-374；518—646)．在烟草悬浮细胞中过量表达NtCDC48能显著提高烟草BY-2细胞的有丝分裂指数,并导致纺锤体微管列阵的两极结构由相对集中转换为极端弥散状态．NtCDC48-GFP融合蛋白在细胞周期M期的亚细胞定位结果表明,NtCDC48随细胞周期进程发生有规律的变化,这些结果表明NtCDC48在植物细胞有丝分裂进程中发挥着重要作用。

植物生长调节剂2,4-D对烟草BY-2细胞粘弹性的影响

本文基于多次泛音、宽频耗散型石英晶体微天平技术,首次检测了2,4-D作用于模式植物烟草BY-2细胞下细胞壁与细胞骨架粘弹性的动态变化规律。结果表明,0.5 mg·L-12,4-D处理下烟草BY-2细胞壁与细胞骨架均变软,在光学显微镜下观察到细胞内物质运输变快。此外,比较了不同浓度(0.1~10 mg·L-1)2,4-D对BY-2细胞粘弹性的影响,在1 mg·L-12,4-D处理下BY-2细胞的粘弹性变化最明显。