蓖麻RcbZIP44基因克隆及表达特性

【目的】克隆蓖麻bZIP转录因子基因RcbZIP44,并进行表达特性分析,为探究bZIP转录因子在蓖麻生长发育及非生物胁迫下的生物学功能提供理论参考。【方法】从蓖麻品种通蓖5号中克隆bZIP转录因子基因家族成员RcbZIP44,对其序列进行生物信息学分析,借助烟草瞬时表达系统对RcbZIP44蛋白进行亚细胞定位,通过实时荧光定量PCR检测RcbZIP44基因在不同组织及非生物胁迫下的表达模式。【结果】克隆获得的RcbZIP44基因cDNA全长612 bp,包含1个456 bp的开放阅读框(ORF),编码151个氨基酸残基,无跨膜区域和信号肽结构,为不稳定的亲水性蛋白,存在21个潜在的磷酸化位点,二级结构以α-螺旋为主,定位于细胞核中。RcbZIP44基因启动子区域含有激素响应元件(ABRE、GARE-motif、TATC-box、TGACG-motif)、胁迫响应元件(LTR、ARE、MRE)等,推测RcbZIP44基因在非生物胁迫中发挥重要作用。RcbZIP44基因在茎中的相对表达量最高,显著高于根、子叶和真叶(P<0.05),说明其具有明显的组织表达特异性。在脱落酸(ABA)、盐、干旱和低温胁迫下,RcbZIP44基因在真叶和根中表现出不同的表达模式。RcbZIP44基因对低温胁迫敏感,处理6 h时的相对表达量最高;RcbZIP44基因在ABA和干旱胁迫下呈先增后减的表达模式,在处理12 h时的相对表达量最高;在盐胁迫中RcbZIP44基因表达较为平缓。【结论】RcbZIP44基因编码的蛋白含有bZIP家族特有的bZIP-plant-GBF1结构域,其主要在茎中发挥调控作用,且该基因受ABA、盐、干旱和低温等非生物胁迫诱导表达,推测RcbZIP44基因在蓖麻生长发育及响应非生物胁迫中发挥重要调控作用。

拟南芥35S∶NAS2载体构建和转基因株系的筛选

为了研究基因NAS2和BZIP44在拟南芥缺铁胁迫响应中的遗传关系,文章以野生型(wild type,WT)拟南芥为材料构建35S∶NAS2/WT转基因植株,以拟南芥突变体bzip44为材料构建35S∶NAS2/bzip44转基因植株;提取野生型拟南芥的RNA,以其反转成的cDNA作为模板克隆NAS2的CDS区域,将双酶切后的目的片段与同样双酶切的pART27质粒进行连接,得到的连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中,通过菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定和测序得到阳性单克隆,然后将重组质粒转入农杆菌感受态GV3101中,获得阳性单克隆菌落;用浸花法分别侵染野生型拟南芥和纯合的拟南芥bzip44突变体植株,通过筛选和鉴定得到纯合的35S∶NAS2/WT和35S∶NAS2/bzip44转基因植株。研究结果为基因NAS2和BZIP44在拟南芥缺铁胁迫响应中的遗传关系提供参考。