基于核酸杂交反应的荧光生物传感器的制备及在黄曲霉毒素B_1检测中的应用

采用核酸适配体作为特异性识别元件,SYBR Green I(SGI)荧光染料为信号输出单元,构建了黄曲霉毒素B_1(AFB_1)生物传感器,并对试验条件进行了优化。优化的试验条件如下:适配体互补链与适配体的物质的量比为1.5,SGI加入量为10μL,适配体双链与SGI的作用时间为2 min,适配体与AFB_1作用时间为14 min。结果表明,在AFB_1质量浓度为0.1~1 000μg·L^(-1)时,荧光强度变化量与其质量浓度对数呈线性关系,检出限(3S/N)为0.081μg·L^(-1)。对实际玉米样品进行加标回收试验,回收率为95.2%~105%,测定值的相对标准偏差(n=7)均小于6.0%。与其他适配体传感器进行比较,该方法所构建的荧光适配体传感器对AFB_1的检测具有操作简便、检测范围宽、灵敏度高、特异性强、成本低廉等优点,适合现场快速测定。

水稻维生素B_1合成相关基因OsTHIC的功能研究

【目的】维生素B_(1)(vitamin B_(1), VB_(1))是生物所必需的微量元素,其作为多个酶的辅因子,参与重要的细胞代谢途径,而水稻中维生素B_(1)合成途径还有待深入研究。本研究旨在解析水稻维生素B_(1)合成相关基因OsTHIC的生物学功能。【方法】综合运用诱变技术、色素测定、Mutmap+、基因编辑及非靶向代谢组分析等手段克隆目的基因并解析其功能。【结果】从EMS诱变的水稻突变体库中发现一个心叶白化致死突变体wll1(white leaf and lethal 1)。wll1从四叶期开始出现心叶白化表型,白化表型逐渐扩展到其他叶片并导致幼苗死亡。与野生型相比,wll1的叶绿素含量与类胡萝卜素含量显著降低。利用Mutmap+及基因编辑技术,确定目的基因为维生素B_(1)合成相关基因OsTHIC。OsTHIC在叶片具有较高表达量,OsTHIC蛋白定位于叶绿体。wll1及OsTHIC的敲除突变体中维生素B_(1)含量均显著低于野生型,外施维生素B_(1)可以恢复wll1的突变表型。外施维生素B_(1)及OsTHIC突变均会影响维生素B_(1)合成相关基因的表达。非靶向代谢组测序分析表明,野生型与wll1差异代谢物在氨基酸的生物合成、辅因子的生物合成、ABC转运器及氨酰基-tRNA的生物合成等方面显著富集。【结论】OsTHIC通过调控维生素B_(1)含量,参与氨基酸合成等代谢过程,在水稻生长发育过程中发挥重要作用。

基于适配体亲和磁珠的黄曲霉毒素B_1单样本前处理试剂盒的制备及应用

黄曲霉毒素B_1(aflatoxin B_1,AFB_1)适配体共价偶联于磁珠表面制备适配体亲和磁珠(aptamer affinity magnetic beads,AAMB),将AAMB、孵育液、洗涤液和洗脱液预封装于试剂条中开发了AFB_1单样本前处理试剂盒,借助真菌毒素全自动净化仪实现了AFB_1前处理的自动化,使用超高效液相色谱仪对洗脱液中AFB_1的含量进行测定。通过优化磁珠粒径、适配体间接臂长度、适配体亲和磁珠用量、孵育液体积确定了AAMB的制备条件以及AFB_1单样本前处理试剂盒的使用条件,对比了手动和自动两种前处理方式下AAMB回收率的差异。在优化条件下,AFB_1的检出限(limit of detection,LOD)为0.6 ng/mL,玉米和小麦中低、中、高三个水平的加标回收率在92.8%~110.1%之间,日内精密度的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)小于5.1%,日间精密度的RSD为6.7%,具有良好的灵敏度、准确性和重复性;粮油基质(玉米、糙米、花生油和花生酱)中AFB_1成分国家有证标准物质的测定结果在其扩展范围内,具有良好的基质适用性。开发的单样本前处理试剂盒借助真菌毒素全自动净化仪仅需一步操作即可在20 min内自动完成10个样品的前处理,具有时间短、通量高、批次间差异小的优点,在真菌毒素定量检测方面具有良好的应用前景,为开发针对其它靶标的自动化前处理方法奠定了基础。

基于复合纳米材料比色/荧光双信号的黄曲霉毒素B_1检测

以黄曲霉毒素B_1(aflatoxin B_1,AFB_1)为检测目标物,使用二氧化硅纳米颗粒为载体富集谷胱甘肽和黄曲霉毒素适配体制备识别探针,二氧化锰纳米颗粒与石墨烯量子点偶联的复合纳米材料为底物,通过谷胱甘肽与底物的反应构建了一种比色和荧光双模信号输出的高灵敏便携式检测平台。在优化条件下,对本方法的检测性能及特异性进行研究,得到比色信号的回归方程为ΔA=-0.275-0.021lg C,检出限为2.732×10^(-12) g/m L;荧光信号的回归方程为ΔF=928.733+71.779lg C,检出限为1.667×10^(-12) g/m L,两种方法都具备良好检测特异性。将该方法用于牛奶、大米、麦片、酱油和白醋5种实际样品中AFB_1的检测,并与传统方法进行对比,本方法结果具有较高的准确度。

基于纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的一步酶联免疫吸附分析法检测黄曲霉毒素B_1

从噬菌体展示的抗黄曲霉毒素B1(AFB_1)纳米抗体文库中,通过四轮亲和淘选,得到抗AFB_1纳米抗体G8。将编码纳米抗体G8的基因与碱性磷酸酶(AP)基因融合,构建了重组融合表达载体pET25b(+)-G8-AP,将其转化大肠杆菌BL21(Rosetta,DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导融合基因表达。SDS-PAGE结果表明,融合蛋白G8-AP为可溶性表达,Ni^(2+)-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,对硝基苯磷酸二钠(pNPP)法测得纯化后的G8-AP的碱性磷酸酶比活力为(364.5±8.3)U/mg。ELISA检测结果表明,G8-AP具有特异识别AFB1的活性,与其它真菌毒素(AFB_2、AFG_1、AFG_2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B_1)无交叉反应。基于G8-AP建立了检测AFB1的一步ELISA法。在优化的条件下,即甲醇浓度20%、盐离子浓度20 mmol/L、pH 7.4条件下,方法的半数抑制浓度(IC_(50))为19.8 ng/mL,线性范围为4.3~92 ng/mL,检出限为2.6 ng/mL。对玉米和小麦样品加标回收实验结果表明,基质对本方法的干扰不明显,可用于实际样品检测。

伏马菌素B_1单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立

制备了高亲和力的伏马菌素B_1(FB_1)单克隆抗体,进而建立了谷物中FB_1的直接竞争化学发光酶联免疫检测方法(dc-CLEIA)。采用碳化二亚胺法成功合成了FB_1人工抗原,经杂交瘤技术获得分泌FB_1特异性抗体的细胞株,高碘酸钠法酶标单克隆抗体后,建立了FB_1的dc-CLEIA,本方法的IC_(50)值为1.43μg/L,线性范围为0.32～8.40μg/L,检出限为0.13μg/L,竞争反应时间仅需20 min。玉米样品加标回收率为100.2%～115.4%,相对标准偏差小于8.7%,谷物样品的检测结果与高效液相色谱法及商业化ELISA试剂盒检测结果相符。

臭氧降解稻谷中不同黄曲霉毒素B_1初始含量效果研究

针对黄曲霉毒素B_1(AFTB_1)污染造成的食用安全性问题,研究了稻谷储藏过程中AFTB_1含量随时间和黄曲霉量的变化规律以及臭氧降解率与稻谷中AFTB_1初始含量的关系。结果表明:30℃时,16.0%水分的稻谷AFTB_1含量(X)与储藏时间(T)呈极显著的抛物线型关系,回归方程为X=3.958T2-30.523T+45.049(R2=0.945,p<0.01),与黄曲霉量(M)呈正线性关系,回归方程为X=3.031E-005M+12.311(R^2=0.955,p<0.01)。随着稻谷中AFTB_1的初始含量增加,臭氧处理后的毒素降解率呈先上升后下降,降解率最大达到88.1%,在给定条件下,可将含68.42μg/kg AFTB_1的稻谷降解到国家限量标准(10μg/kg)。

黄曲霉毒素B_1污染玉米的比重筛分研究

研究比重法对AFB_1污染玉米的筛分效果。结果表明:风量、纵向倾角和振幅对比重筛分效果具有显著影响(P<0.05),且在风量为6 000m^3/h、倾角7°、振幅15mm时,不同污染程度的玉米经比重筛分后,相比原料中的AFB_1含量,重质玉米中AFB_1含量分别降低21.2%和38.4%,轻质玉米和破碎率比例适中。比重筛分机是中国粮食生产中的重要设备,通过比重筛分去除AFB_1污染严重玉米具有良好的应用前景。

黑曲霉菌降解黄曲霉毒素B_1的影响因素的研究

谷物类原料因保管不善造成或加工过程中操作不当易产生大量黄曲霉毒素B_1。目前,微生物法已成为降解黄曲霉毒素B1的研究热点。本研究用已筛选出具有降解黄曲霉毒素B1能力的黑曲霉菌为研究对象,从发酵液不同处理方式,热稳定性,p H稳定性,金属离子稳定性等方面,对其降解的影响因素进行了研究。通过对其发酵液不同处理途径和不同条件对其降解黄曲霉毒素B_1能力的影响的研究,初步判断筛选菌株是通过直接代谢和分泌胞外酶两种途径共同降解黄曲霉毒素B_1的,而分泌胞外酶又是其主要的降解黄曲霉毒素B1的手段,因此易受温度、p H、和金属离子的影响。

水飞蓟素对黄曲霉毒素B_1致毒的红姑鱼幼鱼生长和毒素积累的影响

本文研究了水飞蓟素（Silymarm,SM）对黄曲霉毒素B_1（AFB_1）致毒的红姑鱼幼鱼（6.5±0.5）g生长性能、血清和肝脏生化指标及AFB_1在肝脏和肌肉中残留的影响。试验共分为7组,对照组（A0组）饲喂基础饲粮,A100和A500组在基础饲料中分别添加100、500μg/kg AFB_1,A100-S1、A100-S2、A500-S1、A500-S2组分别在A100和A500组饲料中分别补充0.25、0.5 g/kg SM。试验进行12周。结果表明：AFB_1造成红姑鱼成活率显著下降,而补充SM后成活率显著提高（P〈0.05）;各组红姑鱼形体指标及体组成无显著差异（P〈0.05）;AFB_1导致血清SOD、GPT和GOT活性显著提高（P〈0.05）,而肝脏T-AOC和SOD活性有明显提高,但仍显著低于A0组（P〈0.05）。结论,红姑鱼幼鱼摄食含AFB_1（100~500μg/kg）的饲料后,对其生长性能造成显著抑制,并引起肝脏抗氧化能力显著下降,引发肝损伤;补充SM使红姑鱼生长性能明显恢复,并可降低AFB_1在肝组织的残留。SM对红姑鱼幼鱼抗AFB_1的负面影响具有一定的缓解作用。

复方中药提取物在新城疫B_1株免疫中的免疫增强作用

用自制的中药提取物与新城疫Ｂ１株混合后免疫５５日龄鸡，以血凝抑制试验测定新城疫抗体效价。结果表明，５５日龄鸡的中药提取物最佳用量为１．０ｍＬ，试验组鸡ＮＤ抗体效价明显高于对照组。免疫后６０ｄ用Ｆ４８Ｅ８新城疫强毒进行攻击，试验组的保护率达到１００％，而对照组相对较低。

维生素B_1的镇痛作用

本研究中,作者将维生素B_1注入大鼠侧脑室或腹腔,均表现出镇痛作用。此镇痛作用可被由外周或中枢注入的纳洛酮所对抗,说明维生素B_1的镇痛作用与中枢和外周存在的阿片受体的结合有关。

有机锗抑制AFB_1致肝癌的机制初探

观察了有机锗对黄曲霉毒素B_1(AFB_1)致肝癌作用和免疫功能的影响。结果表明,有机锗对AFB_1诱发的肝癌前病变酶变灶有显著的抑制效果,而对WBC吞噬率、ANAE及MII等免疫功能有显著的增强作用.提示有机锗具有抑制AFB_1的致癌作用,可能与其通过恢复或增强机体免疫功能有关。

高效液相色谱法测定甲硫氨酸维B_1氯化钠注射液中甲硫氨酸含量

目的建立测定甲硫氨酸维B1氯化钠注射液中甲硫氨酸含量的高效液相色谱(HPLC)法。方法采用COSMOSIL5 C18-MS-Ⅱ色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以水为流动相,流速为1.0 mL/min;柱温为30℃,检测波长为228 nm。结果甲硫氨酸质量浓度在70.94~638.46μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 9),平均回收率为100.03%,RSD为0.86%(n=9)。结论该方法准确、简便、快速、重复性好,适用于甲硫氨酸维B1氯化钠注射液中甲硫氨酸的含量测定。

弛豫铁电体Pb(B_1B_2)O_3和钛酸铅固溶体的相稳定性

弛豫铁电体Pb(B1B2 )O3 和PbTiO3 能够形成具有复合钙钛矿结构的二元固溶体Pb(B1B2 )O3 PbTiO3 。到目前为止 ,已经发现了多种这类二元固溶体单晶 (如PMN PT、PZN PT和PSN PT等 )不仅具有良好的介电性能 ,而且具有良好的压电性能。和普通压电陶瓷PZT相比较 ,弛豫铁电单晶的纵向机电耦合系数k3 3 要大得多 ,可以达到 90 %以上。由于缺少这类二元固溶体单晶的高温相图 ,这类单晶的生长比较困难。我们通过对几种具有复合钙钛矿结构的二元固溶体体系 ,进行差热分析 (DTA)和热重分析 (TG) ,分析了固溶体的相关系和相稳定性。并用粉末X射线衍射谱 (XRD)分析了固溶体的结构 ,以便确定相应的单晶生长方法。研究结果表明 ,A(B1B2 )O3 PbTiO3 二元固溶体体系的结果比较复杂 ,体系中除了具有钙钛结构的铁电相之外 ,还有多种焦绿石相 ,而且不同的弛豫铁电体形成的固溶体其相稳定性的差异较大。其中PMN PT固溶体的相稳定性较高。研究结果表明 ,PMN PT固溶体的液相线和固相线比较接近 ,晶体生长中的分凝现象较小 ,可以看作为同成分熔化的化合物 ,故可以用熔体法来直接生长单晶。PZN PT单晶的相稳定性较差 ,需要加入一定量的溶剂才能使相稳定 ,故可以用助熔剂法来生长PZN PT单晶。

Fe^(3+)对V_(B_1)与牛血清白蛋白相互作用的影响

采用荧光光谱法考察Fe^(3+)对V_(B_1)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的影响。试验结果表明,V_(B_1)对BSA的内源性荧光有猝灭作用,猝灭类型为动态猝灭,作用力类型为氢键和范德华力。Fe^(3+)的加入并未改变V_(B_1)对BSA的猝灭类型和作用力类型,但对其猝灭速率常数(k_q)、结合常数(K_A)以及结合位点数(n)会有不同程度的影响。同步荧光光谱显示V_(B_1)主要与BSA中的色氨酸残基作用,引起其构象或周围环境的改变。

伏马菌素B_1胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

目的:为制备一种快速检测玉米中伏马菌素B_1(FB_1)胶体金免疫层析试纸条。方法:采用碳化二亚胺法合成检测抗原FB_1-BSA,柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,辛酸-饱和硫酸铵法对抗FB_1单克隆抗体腹水进行纯化,将金标抗体喷于金标垫,检测抗原FB_1-BSA(T线)和羊抗鼠二抗(C线)喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)。结果:得到的单克隆抗体效价为1.28×105。该试纸条的NC膜喷涂的检测抗原浓度为200μg/m L,羊抗鼠二抗浓度为1.0 mg/mL,喷涂量分别为0.74μL/cm,试纸条灵敏度为20 ng/mL,检测时间只需5 min,试纸条于4℃至少可保存12个月。结论:采用制备的试纸条对玉米实际样品进行检测,检测结果与高效液相和酶联免疫吸附法检测结果相一致,说明该试纸条适合现场快速检测伏马菌素B_1。

饲料中黄曲霉毒素B_1对花鳗存活和生长的影响

黄曲霉毒素是二呋喃香豆素的衍生物,易污染食物、药品原料、农副产品及其制成品,具有强烈的致癌、致畸和致突变作用,被世界卫生组织列为最强的致癌物质（马红岩、马涛,2007）。黄曲霉毒素目前已发现有20种之多,其中黄曲霉毒素B1（AFB1）在所有已知黄曲霉毒素中毒性最强,其毒效相当于砒霜的68倍（黄莹,2011）。AFB1本身并不致癌,其毒性大小取决于体内的代谢活化过程和修复机制（瞿红艳和黄天壬,2007）。

黄曲霉毒素B_1对雄性肉仔鸡的毒害作用及对其肝脏谷胱甘肽硫转移酶活性的影响

以7日龄雄性鹿苑鸡为材料,分别在基础日粮中添加黄曲霉毒素B_1(AFB_1)1 mg/kg和2 mg/kg,饲养到28日龄,每隔7 d观察肉仔鸡生长情况,并测定肝脏谷胱甘肽硫转移酶(GST)催化底物CDNB(2,4-二硝基氯苯)、DCNB(1,2-二氯-4-硝基苯)、p-NBC(4-硝基氯化苄)的活性,研究AFB,对雄性肉仔鸡肝脏GST活性的影响。结果表明:两个处理组的28日龄肉仔鸡体重及平均日增重(ADG)显著降低,21-28日龄肉仔鸡平均日采食量显著降低,21-28日龄肉仔鸡料重比显著升高。1 mg/kg AFB_1组的21日龄肉仔鸡肝脏中GST催化DCNB活力显著降低。2mg/kg AFB_1组的21日龄肉仔鸡肝脏中GST催化CDNB及DCNB活力显著降低。两个处理组的28日龄肉仔鸡肝脏中GST催化CDNB、DCNB及p-NBC活力极显著降低。本试验表明:饲喂含1 mg/kg AFB_1或2 mg/kg AFB_1的日粮21 d,肉仔鸡的生长会受到抑制,肉仔鸡肝脏谷胱甘肽硫转移酶的活性会降低,且饲喂含AFB_1的日粮时间越长,肉仔鸡肝脏谷胱甘肽硫转移酶活性受到的抑制越明显。

中药生柿楴汤与维生素B_1穴位注射对肿瘤患者顽固性呃逆的疗效评价

目的:评价中药生柿楴汤与维生素B_1(VB_1)内关穴穴位注射对肿瘤患者顽固性呃逆的疗效。方法:选取2012年8月—2013年8月间收治的肿瘤顽固性呃逆患者80例,将其随机分为对照组和观察组,每组40例;对照组给予口服中药生柿楴汤治疗,观察组患者在对照组基础上再给予VB_1内关穴位注射治疗,评价两组患者治疗7 d后的总有效率,以及治疗后首次呃逆消失时间和再发作时间。结果:观察组患者治疗后的总有效率为87.50%高于对照组为85.00%(P>0.05);观察组患者治疗后首次呃逆消失时间为(0.386±0.023)h短于对照组为(0.523±0.052)h(P<0.05),呃逆中止首次再发作时间为(6.31±1.39)h优于对照组为(4.38±1.34)h(P<0.05)。结论:采用中药生柿楴汤与穴位注射VB_1治疗肿瘤患者顽固性呃逆的疗效与单用中药生柿楴汤的疗效相当,但联合治疗起效更快,药效长。