ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。

狂犬病病毒核蛋白在Bac-To-Bac/AcMNPV杆状病毒系统的表达

为真核表达狂犬病病毒的核蛋白,本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因,将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中,构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-NP;通过转染昆虫细胞sf9包装重组杆状病毒。SDS-PAGE、western blot和间接免疫荧光对表达的蛋白进行鉴定和反应原性分析。分别以重组杆状病毒表达的核蛋白、原核表达核蛋白为包被抗原进行ELISA检测。结果表明,在昆虫细胞中表达的狂犬病病毒重组核蛋白能与鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清特异性结合,其相对分子量约为50.5ku。以重组杆状病毒表达的核蛋白为抗原建立的rNP-ELISA的敏感性、特异性、符合率分别为86.36%,89.83%,90.00%,优于大肠杆菌表达的RV核蛋白。说明杆状病毒系统表达的核蛋白是建立RV核蛋白ELISA抗体检测方法的理想抗原。

意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

利用BactoBac系统将意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)基因cDNA克隆至转移载体pFastBacHTa中,得到pBacHT-AmPLA2,再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH10Bac中,通过转座作用,得到含AmPLA2基因的重组病毒rBacmid-AmPLA2的DNA。提取其基因组DNA,用脂质体介导转染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,得到重组病毒rACV-Bac-AmPLA2。用此重组病毒感染Tn-5B1-4细胞,在细胞中表达AmPLA2。SDS-PAGE电泳结果显示,与6×HisTag融合表达的产物蛋白分子量约为18kD左右,表达量约占细胞总蛋白的5·35%。Westernblot印迹显示,融合表达产物能与意大利蜜蜂蜂毒AmPLA2抗血清发生免疫反应。生物活性测定显示,含表达产物的细胞蛋白粗提物对底物蛋黄的酶活力约为6·13μmol·min-1·mg-1。

HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性。方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒(P4),通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠(gD2组),以PBS作为阴性对照(PBS组),ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果:PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×109 pfu·mL-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37 000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。

神经营养素-4(NT-4)在昆虫杆状病毒表达系统中的克隆与表达

目的 通过昆虫杆状病毒表达系统的优势，表达出具有生物学活性的神经营养素-4（ hNT-4）蛋白。方法 通过 PCR方法获得 hNT-4成熟肽的基因，将其连接到昆虫表达载体 pAcGP67B上，在昆虫细胞 Sf9中进行表达。对表达产物进行免疫原性和生物学活性测定。结果 获得 hNT-4蛋白的表达产物， SDS-PAGE电泳显示表达产物相对分子质量为 15 000。 经 Western-blot验证，表达上清及细胞全蛋白均有一条能与抗人 NT-4抗体发生特异性免疫反应的条带。经 PC12细胞测定，表达上清中的 rNT-4蛋白具有明确的生物学活性。结论 hNT-4在昆虫杆状病毒表达系统中的表达为今后进一步深入研究 hNT-4的功能及其在临床中的应用提供了条件。

猫传染性腹膜炎病毒N蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因(登录号:KC461235.1),并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1∶102400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。

人CD4胞外区蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达纯化及性质鉴定

目的:通过条件优化实现人CD4蛋白胞外区在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的高效表达,并对纯化获得的人CD4蛋白胞外区进行抗原性与免疫原性分析。方法:通过选择人CD4分子胞外片段构建重组杆状病毒(p Ac-CD4),然后感染昆虫细胞进行蛋白的表达,采用镍离子亲和层析纯化。运用SDS-PAGE、Western blot、体积排阻色谱、ELISA、SPR法等分析纯化得到目的蛋白的理化性质和抗原性。通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫BALB/c小鼠,监测小鼠免疫血清的抗体生成。结果:经纯化可获得纯度90%以上的人CD4蛋白,每升细胞培养液最终可获得11.2 mg的目的蛋白,且该人CD4胞外区蛋白具有良好的抗原性。小鼠血清监测结果显示人CD4蛋白能有效刺激机体产生免疫应答,显示其具有良好的免疫原性。结论:本研究通过杆状病毒-昆虫细胞系统进行高效表达,获得抗原性和免疫原性良好的人CD4胞外区蛋白,为HIV受体和感染的研究奠定基础。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展

真核细胞大部分生命活动是通过复合体催化的。因此,系统了解这些复合体的生物学功能,将在健康和疾病方面具有重要意义。由于内源性复合体存在低丰度和异质性特点,因而直接提取复合体存在一定的困难。杆状病毒-昆虫细胞表达系统可成功表达复合体,为研究复合体的结构和功能提供新的手段。综述近年来利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行蛋白质复合体结构和功能研究的进展。

鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。

蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2(MRJP2),为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid并转染至Sf9昆虫细胞,以P2代杆状病毒感染Sf9细胞进行诱导表达,利用层析柱和离子交换柱对表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE、Western blotting及四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q Exactive)对目的蛋白进行分析验证。结果显示,本试验成功构建杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid,转染至Sf9昆虫细胞并获得表达产物。SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为52 ku的MRJP2重组蛋白,且纯度较高;质谱分析结果显示,该重组蛋白匹配到蜜蜂蛋白质数据库中MRJP2的特异性肽段为39个,序列覆盖率为61%,且与MRJP2的匹配得分最高,进一步确认该重组蛋白为MRJP2。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达出MRJP2,为后续该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。

Tat-Vp3融合蛋白在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达与纯化及其促凋亡功能的研究

目的:采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获取可溶性His-Tat-Vp3融合蛋白,并观察其对细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建重组质粒pFastBac^(TM)1-TAT-VP3,转化DH10Bac感受态细胞,获得杆状病毒质粒,转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒,纯化并扩增该病毒。用最适滴度的病毒刺激Sf9细胞以诱导His-Tat-Vp3蛋白表达,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定,获得分子质量约21 kDa的融合蛋白。采用MTT实验与流式细胞技术检测500、1 000、2 000 nmol/L的融合蛋白抑制肿瘤细胞(HeLa细胞)增殖及促凋亡的活性。结果:通过昆虫表达系统成功表达及纯化出Tat-Vp3融合蛋白,其中1 000、2 000 nmol/L融合蛋白组可显著抑制肿瘤细胞的增殖,并提高细胞的凋亡率。结论:成功构建His-TAT-VP3融合蛋白昆虫系统表达载体,在昆虫表达系统中可诱导性可溶性高表达,所获融合蛋白能显著抑制HeLa细胞的增殖,并促进其凋亡。

肠道病毒71型VP1蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达

目的利用昆虫杆状病毒表达系统表达肠道病毒71型VP1蛋白并对其进行纯化。方法首先通过化学合成法合成EV71 VP1基因,然后将EV71 VP1基因插入到供体质粒pFast Bac1中,构成重组质粒pFast Bac1-VP1,再转入JM190感受态细菌扩增,然后提取重组质粒pFast Bac1-VP1转入DH10BacTM感受态细胞,通过转座从而获得重组质粒bacmid-VP1,采用脂质体Cellfectin Reagent将重组质粒bacmid-VP1转染Sf9细胞。通过SDS-PAGE、Western blot法检测目的蛋白的水平,经镍离子亲和层析,纯化VP1蛋白。结果 SDS-PAGE及Western blot法检测获得蛋白的相对分子质量与预期结果一致。Bradford分析纯化后蛋白的浓度为70μg/m L,纯化度达90%。结论利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达EV71 VP1蛋白。

犬瘟热病毒N基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及应用

目的：为检测犬瘟热抗体提供诊断抗原，应用Bac～to～Bac杆状病毒表达系统表达犬瘟热病毒（caninedistempervirus，CDV）N蛋白。方法：采用RT～PCR克隆CDV～N基因，

棉铃虫组织蛋白酶B在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

以棉铃虫(helicoverpa armigera)组织蛋白酶B作外源基因重组构建克隆载体,自重组菌株HCB-DH10Bad、Histag-HCB-DH10Bac中提取穿梭质粒,脂质体法转染草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf21细胞,转染液再感染细胞,收集感染3～4 d的上清液,提取芽生病毒的DNA,PCR法鉴定外源HCB基因,感染上清进行SDS-PAGE、Western-blotting、蛋白酶活性检测.结果:感染上清中的芽生病毒的DNA作模板扩增出预期的1 700bp片段,SDS-PAGE、Western-blotting检测均在28ku处有明显表达产物,且表达产物有蛋白水解活性.

Bac-to-Bac系统的研究进展及在家蚕中的应用

Bac-to-Bac策略是目前昆虫杆状病毒表达系统获取重组杆状病毒最为方便、快捷的途径之一。以Bac-to-Bac系统面向的苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcMNPV)表达系统、家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统、棉铃虫杆状病毒(HaNPV)表达系统等3个主要子系统为对象,从宿主域逐渐扩大、蛋白的表达水平不断提高、筛选和纯化更为简便高效以及在家蚕中应用的状况等角度,对Bac-to-Bac系统的发展及功能、特点等进行了阐述。

基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统的SARS-CoV-2 S1蛋白的高效表达

目的 设计、构建表达新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2) S1蛋白的重组杆状病毒,建立并优化其在昆虫细胞中的生产工艺,为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断方法的建立及疫苗开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术将S1基因插入pFastBac^(TM)1质粒,获得重组质粒pFastBac-S1,经转座获得重组杆粒rbacmid-S1,转染Sf9细胞后包装获得重组杆状病毒rBV-S1,通过rBV-S1感染High Five^(TM)(Hi5)细胞表达S1蛋白,使用Western blot分析鉴定S1蛋白的表达。在此基础上,建立优化rBV-S1扩增和蛋白表达的工艺,以实现S1蛋白的高效表达。结果 通过特异性引物PCR扩增重组质粒pFastBac-S1与重组杆粒rbacmid-S1,获得大小分别为2 367 bp、4 370 bp的基因片段,表明S1基因成功克隆入pFastBac^(TM)1质粒与bacmid;采用Western blot分析细胞培养上清液,在78 ku处有特异性反应条带,证明在昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(Insect cell-baculovirus expression vector system, IC-BEVS)中成功表达有反应原性的S1蛋白。Sf9细胞以1.5×10^(6)cells/mL接种,MOI=0.01接毒,96 hpi可收获最大病毒滴度为(8.40±0.16)lgTCID_(50)/mL;Hi5细胞以0.8×10^(6)cells/mL接种后培养36 h,以MOI=1接毒,48 hpi可获得最大S1蛋白产量为(4.33±0.09) mg/L。结论 利用IC-BEVS成功表达了S1蛋白,并建立了优化的S1蛋白生产工艺,实现了S1蛋白的高效表达,对COVID-19临床诊断方法的建立及疫苗开发具有重要意义。

neuritin基因杆状病毒表达载体的构建

为研究Neuritin蛋白的功能,将neuritinORF在杆状病毒-昆虫表达系统中表达,构建杆状病毒表达载体。以308D10为模板,利用PCR方法扩增neuritinORF,定向克隆法将其克隆至PFASTBAC-HTA转移载体中。然后利用同源重组原理将其转移至杆粒bacmid中。得到携带neuritin ORF的重组杆粒。本实验获得了重组目的基因真核表达载体并经PCR鉴定,插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符,成功构建了Neuritin的杆状病毒表达载体。

日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒的构建和鉴定

目的利用杆状病毒-昆虫细胞系统构建日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)Sj16基因重组杆状病毒。方法从日本血吸虫尾蚴提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Sj16基因全编码区序列,将其克隆到载体pET30a(+)中,通过PCR将Sj16基因连同pET30a(+)多克隆位点下游的6×His·Tag一起扩增出来,插入donor载体pFastBacHTa中,构建重组杆状病毒donor载体pFastBacHTa-Sj16-His,转化大肠杆菌DH10Bac-GFP进行转座,提取重组Bacmid,用Lipofectin法转染昆虫细胞Sf9使其包装成有感染性的重组杆状病毒。结果构建了含日本血吸虫Sj16基因的重组Bacmid-GFP-Sj16-His,转染Sf9细胞后,获得了有感染力的重组杆状病毒。结论成功构建了日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒,为下一步重组Sj16蛋白表达和Sj16基因功能研究打下了基础。

密码子优化的鸭坦布苏病毒E基因在昆虫细胞中的表达

为了使鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)的E蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统中高效表达,本研究将DTMUV的E基因按照昆虫细胞偏嗜性密码子进行了优化,合成了基因optiE,并将其插入到pFastBac HT载体上,得到质粒pFastBac-optiE。将该质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组转座子rBacmid-optiE。将rBacmid-optiE转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验和Western blot方法都证实目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。本研究为进一步研究DTMUV E蛋白的结构与功能奠定了基础。

应用bac—to—bac杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中重组表达保守性多巴胺能神经营养因子蛋白

保守性多巴胺能神经营养因子（CDNF）是一类新型神经营养因子，可能对帕金森病（PD）具有一定的治疗作用。我们通过bac—to—bac杆状病毒表达系统，在sf9昆虫细胞中成功诱导表达出重组CDNF蛋白。