狂犬病病毒核蛋白在Bac-To-Bac/AcMNPV杆状病毒系统的表达

为真核表达狂犬病病毒的核蛋白,本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因,将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中,构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-NP;通过转染昆虫细胞sf9包装重组杆状病毒。SDS-PAGE、western blot和间接免疫荧光对表达的蛋白进行鉴定和反应原性分析。分别以重组杆状病毒表达的核蛋白、原核表达核蛋白为包被抗原进行ELISA检测。结果表明,在昆虫细胞中表达的狂犬病病毒重组核蛋白能与鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清特异性结合,其相对分子量约为50.5ku。以重组杆状病毒表达的核蛋白为抗原建立的rNP-ELISA的敏感性、特异性、符合率分别为86.36%,89.83%,90.00%,优于大肠杆菌表达的RV核蛋白。说明杆状病毒系统表达的核蛋白是建立RV核蛋白ELISA抗体检测方法的理想抗原。

昆虫杆状病毒表达载体系统的研究及应用

昆虫杆状病毒表达载体系统具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工,并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品,该系统的建立和发展,被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展。文章介绍了该系统的产生、发展和技术原理,同时概述了该系统在基础研究、医药和农林业等领域的应用情况。

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素 (pGH)基因的cDNA进行测序 ,得到 pGHcDNA的全序列 ,并与Seeburg等报道的序列进行了比较和讨论。然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白XIV启动子的转移载体质粒 pSXIVVI+ X3/ 4构建出含 pGH基因的重组质粒 pX3/ 4 pGH。将 pX3/ 4 pGH与致死缺失型线性化AcMNPV OCC- DNA共转染Sf9细胞 ,构建出既能形成多角体又能表达 pGH基因的苜蓿丫纹夜蛾核多角体重组病毒AcMNPV pX3/ 4 pGH OCC+ 。感染重组毒株的Hi 5细胞可溶蛋白及其培养上清的SDS PAGE和Westernblot的分析结果表明 ,感染细胞的蛋白电泳带的 2 0 .7kDa处有一条猪生长激素特异带 ,但培养上清中没有。凝胶黑度扫描估测结果显示 pGH蛋白占细胞可溶蛋白的 4 .4 8%。

蚕杆状病毒载体表达系统及其在动物疫苗生产中的应用

就杆状病毒的分子生物学特性及其作为表达载体以蚕体为表达外源基因的特点和优点进行综述 。

杆状病毒表达载体系统

杆状病毒表达载体系统是近年来发展起来的较高效的表达外源基因系统。由于多角体病毒中多角体蛋白基因的非必需性、高表达性、重组病毒的易鉴定等特性,以及多角体蛋白基因的强启动子使其特别适于基因工程中作为表达载体,借助于转移载体可将外源目的基因转移到野生型AcMNPV中,在一个被转移载体和野生型AcMNPV共转染的细胞内,可以通过同源重组完成目的基因的转移。应用不同的转移载体可表达出融合及非融合蛋白质。经该系统表达的重组蛋白质具有生物学活性,其中大部分进行翻译后剪接产生与天然蛋白质相似的重组蛋白质。这些产物的抗原性,免疫原性和功能都与天然蛋白质非常相似。目前,应用该系统已成功地表达了许多酶、生长因子、病毒抗原包括病毒的外壳蛋白等有生物活性的蛋白质。本文对如何最大限度表达外源基因及该表达系统的发展前景作了讨论。

昆虫杆状病毒表达载体系统与疫苗研制的30年回顾

1983年12月,一篇关于用昆虫杆状病毒感染昆虫细胞表达重组人β干扰素文章的发表,标示了杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system,BEVS)的诞生。迄今为止,已采用BEVS表达生产了数千种重组蛋白,其中7种已被成功用于商品化人用或兽用疫苗的抗原。仅对30年来基于BEVS的疫苗研制作一论述。

杆状病毒表达载体系统的特点及其在寄生虫学上的应用

杆状病毒载体表达系统使用一个或多个启动子 ,将外源目的基因插入到启动子下游 ,获得重组病毒 ,这种重组病毒在昆虫细胞或虫体内复制的同时 ,使外源基因得到表达。随着杆状病毒分子生物学和表达载体研究的不断深入 ,作为真核表达载体 ,该系统区别于其他表达系统的特点更为突出 ,主要表现在目的基因容量、表达效率、目的蛋白活性、可操作性。

伪狂犬病病毒鄂A株囊膜蛋白gD基因在杆状病毒载体系统中的表达研究

克隆了伪狂犬病病毒鄂A株囊膜蛋白gD基因并进行了序列分析 ,与国际标准毒株Rice株相比 ,两者之间核苷酸序列同源性为 98% ,推导氨基酸序列同源性为 97% .利用杆状病毒GST融合载体系统对其进行了高效表达 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹均证明了表达产物为 71ku的GST gD融合蛋白 ,其产量占细胞不溶蛋白量的 2 0 %左右 .以GST gD融合蛋白作为抗原进行小鼠免疫保护实验 ,结果表明表达的GST gD融合蛋白具有较好的免疫原性 ,不仅能诱导小鼠产生血清抗体 (1∶12 8) 。

杆状病毒载体表达系统研究的新进展

杆状病毒是主要对昆虫显示病原性的一类病毒,可感染600多种昆虫,是自然生态体系统中调节虫口密度的主要生物因子之一。它以大的棒状病毒粒子、内含分子量为28～60kb 的闭环超螺旋双链 DNA 基因组的特征。分类上将杆状病毒种分为3个亚组:A 亚组的核多角体病毒,以多角体蛋白结晶基质包涵许多有囊膜的核衣壳形成多角体为特征;苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)和家蚕核多角体病毒(BmNPV)分别为多粒包埋型和单粒包埋型为代表种,B

昆虫杆状病毒表达载体系统的研究进展

杆状病毒表达载体系统是当前基因工程四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的合成。文章对杆状病毒表达载体筛选、用于蛋白生产的昆虫细胞培养的研究现状、存在的问题、解决途径和展望进行了较详细的论述。

利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBV C基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual-HBV core,转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座,提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9,获得含有HBV C基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达,然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBV C基因的重组杆状病毒,而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统,成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白,为进一步研究奠定了基础。

杆状病毒表达载体系统研究和应用

自从1983年Smith等人首次报道利用杆状病毒作为载体在昆虫细胞中表达人β-干扰素以来,杆状病毒表达载体系统的基础和应用研究发展迅速。杆状病毒作为基因表达载体具有能够提供指导外源基因高水平表达的强启动子、介导外源基因在真核细胞(昆虫细胞)环境中表达和使用安全等优点,在基因工程疫苗诊断和治疗试剂的生产、生物杀虫剂的改良以及作为分子生物学研究的实验系统等方面具有广阔的应用前景。

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 。

昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展

昆虫杆状病毒表达系统 (BEVS)因具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点 ,现已成功表达了近千种高价值蛋白。随着杆状病毒载体的不断改进 ,该系统获得重组病毒的几率已从最初的 0 1 %～ 1 %提高到现在的 80 %～ 90 %以上 ,并且出现了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体和高水平表达重组蛋白的昆虫细胞系。杆状病毒载体将在未来药物研发、疫苗生产、基因治疗、重组杆状病毒杀虫剂等领域得到广泛应用。但存在的一些问题如杆状病毒的基因组学研究相对薄弱 ,有关病毒晚期基因的高表达和调控机制等还不十分清楚 ,表达产物的纯化比较困难 ,多元表达等方面的技术还不够成熟等 ,均有待进一步解决。

杆状病毒——高效蛋白表达载体

杆状病毒（Baculovirus）是昆虫专一性的病原病毒，是目前为止发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒。杆状病毒表达载体系统 （Baculovirus expression vector ,ystem, BEVS）是一个以杆状病毒为外源基因载体，昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。与其他表达系统相比，它具有能容纳较大的外源基因插入；可同时表达多个基因；表达水平高；表达产物可进行包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等在内的翻译后加工修饰；

人胰岛素基因杆状病毒表达载体的构建及其在Sf_9细胞中的表达

对人胰岛素基因组基因真核表达载体 ( p CMA/m INS)进行 Xho 酶切 ,回收的含人胰岛素基因组基因的 1 60 8bp片段与线性化的杆状病毒载体 p Fast Bac 进行连接 ,获得重组载体 p Fast/m INS。将该重组载体转化 DH1 0 Bac感受态细菌 ,在体内进行重组 ,并经 2次抗性与蓝白斑筛选 ,得到杆状病毒重组载体 Bacmid/m INS。将该载体转染 Sf9细胞 ,获得了重组杆状病毒 ,经 Tricine-SDS-PAGE和 Western-blotting检测 ,重组杆状病毒在 Sf9细胞中的表达产物是胰岛素原 。

宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。

口蹄疫病毒多基因片段的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

根据定点突变原理获得了包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分 2B编码区的目的基因片段 ,经SpeⅠ和HindⅢ双酶切后 ,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体 pFastBacHT连接 ,得到了重组质粒 pFB P12X3C3D。经酶切和测序鉴定后 ,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac ,经抗性及蓝白斑筛选 ,得到了含P12X3C3D多基因的重组穿梭载体 ,将其命名为Bacmid P12X3C3D ;提取其DNA并转染Sf9昆虫细胞 ,最后获得含口蹄疫病毒P12X3C3D多基因的重组杆状病毒。

J亚群禽白血病Hrb-1分离株env基因克隆及gp85杆状病毒表达载体的构建

自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT＿PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS＿103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18＿T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取质粒分别用HindIII,BamHI进行单酶切和双酶切鉴定,得到了阳性重组质粒pMD18＿T＿Hrb＿1/env,对其进行PstI酶切,回收包含J亚群禽白血病病毒株Hrb＿1gp85基因的997bp片段,应用BactoBac杆状病毒表达系统,将外源片段与线性化的杆状病毒载体pFastBacHTA进行连接,获得重组载体pFASTBacHTA/gp85,将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得了杆状病毒重组载体Bacmid/gp85,为表达gp85并建立适于国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础。