狂犬病病毒核蛋白在Bac-To-Bac/AcMNPV杆状病毒系统的表达

为真核表达狂犬病病毒的核蛋白,本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因,将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中,构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-NP;通过转染昆虫细胞sf9包装重组杆状病毒。SDS-PAGE、western blot和间接免疫荧光对表达的蛋白进行鉴定和反应原性分析。分别以重组杆状病毒表达的核蛋白、原核表达核蛋白为包被抗原进行ELISA检测。结果表明,在昆虫细胞中表达的狂犬病病毒重组核蛋白能与鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清特异性结合,其相对分子量约为50.5ku。以重组杆状病毒表达的核蛋白为抗原建立的rNP-ELISA的敏感性、特异性、符合率分别为86.36%,89.83%,90.00%,优于大肠杆菌表达的RV核蛋白。说明杆状病毒系统表达的核蛋白是建立RV核蛋白ELISA抗体检测方法的理想抗原。

EV71型vP1蛋白表达、纯化及免疫原性的初步评价

目的运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达新肠道病毒EV71 vP1蛋白(EV71vP1),并对EV71 vP1蛋白的免疫原性进行初步评价。方法利用RT-PCR技术获得EV71 vP1基因,将基因序列克隆到载体pFastBac HTA,通过转座反应,与Bacmid DNA重组,重组后转染Sf9昆虫细胞。采用透射电镜观察法、SDS-PAGE、Western-blot方法对vP1蛋白进行验证,利用ELISA、微量中和抗体方法对蛋白的免疫原性进行初步评价。结果 EV71 vP1蛋白相对分子量约为33KD,表达量约10mg/L;ELISA抗体效价为1∶900;中和抗体效价1∶800。结论利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功的表达了EV71 vP1蛋白,并对其免疫原性做了初步评价,为今后EV71 vP1亚单位疫苗的研究提供参考。

利用杆状病毒表达系统表达PRV/gE蛋白及间接免疫荧光抗体(IDF)检测方法的建立

为了建立高效灵敏的伪狂犬病病毒(PRV) gE蛋白的间接免疫荧光抗体诊断方法,本研究将PRV/HN/SMX/2012毒株gE蛋白的自身信号肽及胞外域片段克隆到pFastBacHT B载体上,构建重组质粒pFastBacHTB-gE,并转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经过3次蓝白斑筛选获得含有gE基因的重组杆粒rBacmid-gE。随后,将该杆粒转染至sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rAcMNPV-gE。经Western blot和间接免疫荧光实验(IFA)进行鉴定分析,发现重组gE蛋白在sf9细胞中表达。利用该sf9细胞建立检测血清中gE抗体的间接免疫荧光抗体(IDF)方法,通过反应条件的优化发现,将血清和羊抗猪FITC-IgG分别进行1∶40和1∶2 000稀释时所建立的方法能针对血清中gE抗体产生较强的特异性荧光;通过与商业化的ELISA检测gI/gE试剂盒(IDEXX)比较,所建立的检测方法与商业化试剂盒的总符合率为93.18%(164/176),阳性结果符合率93.75%(120/128),阴性结果符合率91.67%(44/48),2种方法存在很强的一致性(Kappa=0.832,CI=95%);-20℃条件下保存2个月的稳定性和重复性良好。

激活素受体样激酶4,5和7抑制剂体外高通量筛选模型的构建

目的构建适于高通量筛选的激活素受体样激酶4(ALK4),ALK5和ALK7抑制剂的筛选模型。方法利用Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建ALK4激酶结构域(ALK4kd),ALK5kd和ALK7kd及Smad2和Smad3蛋白的病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,表达目的蛋白;通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和柱纯化,获得纯化的目的蛋白;分别以纯化的ALK4,ALK5,ALK7激酶片段与纯化的Smad3和ATP构建ALK4,ALK5,ALK7激酶活性测定体系,优化各反应底物浓度及反应条件,建立适于通量化分析的筛选模型;以已知ALK激酶抑制剂SB431542为工具分子,检测其对激酶的抑制活性,确证筛选模型的可靠性。结果经酶切和PCR鉴定,所得重组Bacmid均正确。转染Sf9昆虫细胞后纯化获得相应目的蛋白。经条件优化,反应体系中激酶和底物蛋白Smad3最佳浓度均为10 mg·L^(-1),ATP最佳初始浓度为10 nmol·L^(-1)。所得ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制剂筛选体系的Z′因子分别为0.71,0.51和0.74,符合高通量筛选要求。已知SB431542在所建模型上对ALK4kd,ALK5kd和ALK7kd的抑制活性IC50值分别为22,188和91 nmol·L^(-1)。结论成功构建了ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制剂的体外筛选模型。

日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒的构建和鉴定

目的利用杆状病毒-昆虫细胞系统构建日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)Sj16基因重组杆状病毒。方法从日本血吸虫尾蚴提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Sj16基因全编码区序列,将其克隆到载体pET30a(+)中,通过PCR将Sj16基因连同pET30a(+)多克隆位点下游的6×His·Tag一起扩增出来,插入donor载体pFastBacHTa中,构建重组杆状病毒donor载体pFastBacHTa-Sj16-His,转化大肠杆菌DH10Bac-GFP进行转座,提取重组Bacmid,用Lipofectin法转染昆虫细胞Sf9使其包装成有感染性的重组杆状病毒。结果构建了含日本血吸虫Sj16基因的重组Bacmid-GFP-Sj16-His,转染Sf9细胞后,获得了有感染力的重组杆状病毒。结论成功构建了日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒,为下一步重组Sj16蛋白表达和Sj16基因功能研究打下了基础。

2型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段的表达及其抗原性分析

目的获得单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白G(gG2)免疫优势片段gG321-580并初步研究其抗原性。方法 PCR扩增gG321-580基因,利用Bac-to-Bac表达系统表达gG321-580His融合蛋白,Western blot和间接ELISA鉴定蛋白活性。结果在Sf9细胞中成功表达HSV-2 gG321-580His蛋白,gG321-580His能与小鼠抗HSV-2 gG2单抗结合,在60 KDa附近出现特异性结合条带,ELISA分析初步证实gG321-580His能够与HSV-2阳性血清反应,而不与HSV-1阳性血清和正常人血清反应。结论 gG321-580His蛋白获得成功表达,ELISA检测显示其具有良好的抗原性,为研究以gG321-580蛋白作为靶区域的HSV-2型特异性诊断试剂盒打下实验基础。

H9N2亚型禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达

为了获得具有良好免疫活性的H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白,本研究利用Bac-to-Bac昆虫-杆状病毒表达系统对H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白进行表达。运用PCR对H9N2亚型禽流感病毒HA基因进行扩增,将HA基因连接于转移载体pFastBacDual的BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点之间,构成pFastBacDual-HA重组载体;将pFastBacDual-HA转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,利用蓝白斑筛选法和PCR方法对阳性菌落筛选重组杆粒Bacmid-HA;重组杆粒Bacmid-HA对Sf9昆虫细胞进行了转染,获得重组杆状病毒rBV-HA;运用SDS-PAGE电泳和Western blotting分析rBV-HA感染的细胞和细胞上清。结果表明,重组HA蛋白大小约为65 kD;Western blotting分析显示,HA蛋白与免疫H9N2禽流感病毒后获得的阳性血清具有良好的特异性反应,为进一步研制针对HA蛋白的H9N2亚型AIV亚单位疫苗和研发H9亚型ELISA抗体检测试剂盒奠定了基础。

手足口病CA16型VP1亚单位疫苗的构建制备及免疫原性初步分析

目的制备CA16型VP1蛋白疫苗并进行免疫原性初步分析，为手足VI病CA16疫苗的深入研究提供资料。方法利用RT—PCR技术获得CA16VP1基因，克隆到载体pFastBacHTA，与BacmidDNA重组，转染Si9昆虫细胞，重组CA16VP1蛋白与AI（OH），佐剂混合制备重组CA16VP1蛋白疫苗，腹腔免疫BALB／c小鼠，2次免疫后进行免疫效果初步评价。结果用间接免疫荧光、SDS—PAGE和Westernblot法，证明重组CA16VP1蛋白在昆虫细胞St9中得到表达，用ELISA和微量中和法检测到免疫小鼠血清有特异IgG和中和抗体产生，最佳免疫抗原剂量为20μg，其特异IgG效价为1：1600，中和抗体效价为1：250；通过淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定，证明诱导T细胞应答，诱发Th1／Th2型免疫应答。结论CA16VP1基因克隆成功，并在Sf9昆虫细胞中获得表达，构建的重组CA16VP1亚单位疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力，为今后研制手足口病CA16疫苗奠定了基础。