枯草芽孢杆菌JSIM-X-13-4突变株腺苷发酵研究

对1株黄嘌呤、硫胺素、组氨酸三重缺陷型及8-氮杂鸟嘌呤抗性的腺苷突变株JSIM-X-13-4进行了摇瓶、自控罐3、000 L中型发酵罐试验。试验发现,该菌株培养基成分除酵母膏外,其余与其亲株肌苷产生菌JSIM-1019基本相同。酵母膏浓度为1.6%-1.8%,摇瓶CaCO3量为3%;发酵罐上适宜pH为6.2,风量在18h提高至1∶0.55,溶氧40%。摇瓶、自控罐、中型发酵罐产苷分别为15.51 g/L、18.11 g/L和17.25 g/L。

N离子束注入与DES复合诱变选育腺苷高产菌株

为了获得腺苷高产菌株,以肌苷产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HSD1206(Ade-、Thi-、SGr)为出发菌株,通过硫酸二乙酯(DES)处理、N离子束注入进行单因子和复合诱变。参照菌种致死率曲线,确定N离子束注入250 s与DES处理10 min为最佳诱变时间。经过多轮诱变和筛选,获得了黄嘌呤、硫胺素、组氨酸三重缺陷型,腺嘌呤脱氨酶活性缺失及磺胺胍抗性菌株DI4-24和DI4-182,其遗传标记为Xan-、Thi-、His-、Deam-、SGr,连续传代后性状稳定,在优化的发酵培养基中发酵后腺苷产量可分别达到18.56 g/L和17.13 g/L。由此证明,通过物理、化学复合诱变,阻断枯草芽孢杆菌营养缺陷型菌株产肌苷途径,打通合成腺苷途径的诱变思路在实验室环境下是可行的。

利用枯草芽孢杆菌发酵生产环磷腺苷的工业化试验

为了实现环磷腺苷的发酵生产,对一株枯草芽孢杆菌Bacillus.subtilis jsim-1277在摇瓶、自控罐、20 M3发酵罐上的发酵条件进行了试验。结果表明,最适宜发酵条件是p H 6.7,且添加K2HPO41.0 g/d L,Na F 0.05 g/d L;在摇瓶、自控罐、大型发酵罐产苷分别为7.17、6.01、7.10 g/L。

黄嘌呤缺陷型枯草杆菌的选育

腺苷具有重要的医学价值,用发酵法生产腺苷有很大的经济意义.根据革兰氏阳性枯草芽孢杆菌的腺苷代谢途径,认为黄嘌呤缺陷型的枯草杆菌可以作为腺苷的生产菌株,通过实验研究了枯草杆菌的黄嘌呤缺陷型菌株的选育方法并检验了腺苷的产量.

腺苷生产菌株的回复突变和性质检验

腺苷具有重要的医学价值,由RNA降解获取腺苷成本极高,用微生物发酵法生产腺苷具有重大的经济意义.作为腺苷的生产菌株,黄嘌呤缺陷型的枯草芽孢杆菌如果在生产过程中发生回复突变将会降低腺苷产量.本实验研究了枯草杆菌的黄嘌呤缺陷性菌株是否会回复突变、以及突变菌株的各种性质,进行了V.P.,硝酸盐,高盐浓度,淀粉水解检验,以及进一步的IMP脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、腺苷脱氨酶的活性分析,发现大量菌株发生回复突变,该缺陷型菌株遗传非常不稳定,这些突变菌株与生产菌株相比,IMP脱氢酶活发生显著变化,黄嘌呤氧化酶与腺苷脱氨酶的活力没有明显变化.

重组枯草芽孢杆菌分泌表达腺苷酸脱氨酶

目的:利用基因重组技术,构建腺苷酸脱氨酶高效表达的重组菌株。方法:以前期构建的产腺苷酸脱氨酶重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28α-AMPD中来源于鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)目的基因为模板,设计特异性引物扩增腺苷酸脱氨酶基因,亚克隆至游离型表达载体pHY-WZX,转化枯草芽孢杆菌WB600。结果:成功筛选获得了一株产腺苷酸脱氨酶重组枯草芽孢杆菌WB600/pHY-AMPD,进一步在摇瓶中探究了发酵培养基成分对重组酶发酵的影响。获得了较优发酵培养基为:葡萄糖10 g/L、?酵母膏30 g/L、CaCl2 0.5 g/L、柠檬酸三钠1 g/L、NaH2PO4 10 g/L、K2HPO4 10 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L,37℃、200 r/min发酵60 h摇瓶发酵液酶活力可达到(2 230±50)U/m L。结论:本研究实现了鼠灰链霉菌来源的腺苷酸脱氨酶基因在枯草芽孢杆菌中表达。

有机氮源对腺苷发酵的影响

腺苷在生理生化过程中起着重要的调控作用,具有较高的药用价值,在医药领域有着广泛的应用。主要研究了玉米浆、豆饼水解液和酵母粉等有机氮源对腺苷发酵产苷的影响。在5 L发酵罐上通过添加不同浓度的有机氮源,考察枯草杆菌XGL在不同条件下的菌体生长与产苷情况。通过实验优化,获得最佳的有机氮源为玉米浆20 mL/L、豆饼水解液30 mL/L、酵母粉16 g/L,在此条件下发酵50 h,腺苷最高产量达到41.6 g/L,比初始发酵条件提高65.1%。

H_2O_2对枯草芽孢杆菌生长代谢以及腺苷发酵的影响

通过摇瓶发酵试验研究H2O2对枯草芽孢杆菌ATCC21616生长代谢及产苷的影响。结果表明:添加时间、浓度以及两者的交互作用显著影响腺苷的积累,在12h添加20mg/L的H2O2最利于腺苷的合成,产苷量由7.03g/L增至7.79g/L。同时也研究了H2O2添加对代谢过程中糖耗及pH的影响。

常压室温等离子体与5-溴尿嘧啶复合诱变及快速选育腺苷高产菌株

采用常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma, ARTP)与5-溴尿嘧啶(5-bromouracil, 5-BU)对枯草芽孢杆菌B-0进行复合诱变,通过磺胺胍(sulfaguanidine, SG)抗性初筛、48孔板定量复筛的培养方法快速选育腺苷高产菌株。结果显示,48孔板在枯草芽孢杆菌发酵过程中存在边缘孔效应,并应用2 mL无菌水填充可消除边缘孔效应,且通过6轮复合诱变最终获得1株较出发菌株腺苷产量提升35%且遗传稳定的突变株B-6。ARTP与5-BU复合诱变结合48孔板快速选育,显著提高腺苷高产菌株选育效率与选育的准确率,也为其他核苷类菌株的选育提供了理论参考。

黄嘌呤和谷氨酰胺对枯草芽孢杆菌XGL产腺苷的影响

该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XGL为出发菌株,探究黄嘌呤和谷氨酰胺添加量及添加方式对其产腺苷的影响。结果表明,底物中添加100 mg/L黄嘌呤并在发酵16 h后持续向发酵液中流加3 g/L的黄嘌呤溶液200 m L可使腺苷产量达到34.4 g/L,相比于不流加黄嘌呤时腺苷产量(11.2 g/L)提高207%。在此基础上,再向底物中添加6 g/L谷氨酰胺,发酵32 h之后持续向发酵液中流加6 g/L的谷氨酰胺,腺苷产量达到45.8 g/L,相比于不添加谷氨酰胺腺苷产量(34.4 g/L)提高33%。因此,在B. subtilis XGL发酵过程中,可以通过底物添加和流加补料的发酵方式加入一定量的黄嘌呤和谷氨酰胺以提高腺苷产量。

B族维生素对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响

为了进一步提高发酵法生产腺苷的效率,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XGL为供试菌株,通过单因素试验及正交试验探究VB_(1)、VB_(3)、VB_(5)、VB7、VB_(12)几种关键B族维生素对菌体生长及菌体产苷能力的影响。结果表明,VB_(1)、VB_(3)、VB_(5)、VB7、VB_(12)的最佳添加量分别为6.0 mg/L、5.2 mg/L、6.0 mg/L、2.4 mg/L、5.6 mg/L。此时的菌体生物量(OD_(600 nm)值)、腺苷产量和糖苷转化率分别为74.84、53.66 g/L、33.10%,较原始培养基分别增长了8.00%、19.35%和12.59%,说明B族维生素的这种复合添加量能够较好的提高腺苷的发酵生产能力,为枯草芽孢杆菌发酵法生产核苷类物质的培养基改良提供了一定的依据。

溶解氧控制对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响

在50 L的生物反应器中,通过控制溶解氧水平为5%、10%、20%、30%四个水平考察枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响,发现该菌株生长的溶解氧浓度在10%～20%。并通过发酵过程中菌株的生长情况、菌体摄氧率和发酵产苷进行相关分析。结果表明,在发酵过程中DO水平控制在10%～20%时腺苷积累量高,发酵液中DO水平为5%和30%均不利于发酵液中的腺苷积累。通过对发酵终点丙酮酸的检测,发现枯草芽孢杆菌在低溶氧状态下比高溶氧状态下积累更多的丙酮酸。在此基础上,提出两阶段DO控制策略,最终腺苷积累量达到20.1 g/L。

添加柠檬酸钠与次黄嘌呤的腺苷发酵工艺研究

腺苷在医药和食品领域有广泛的应用。通过发酵工艺调控和培养基优化,提高腺苷发酵得率和糖苷转化率,是工业化生产腺苷的重要途径之一。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AR090为出发菌株,研究发酵培养基中柠檬酸钠和次黄嘌呤的添加量及添加方式对其生产腺苷的影响。结果表明:发酵培养基中添加2 g/L柠檬酸钠,并在发酵过程的24 h和36 h分2次补充次黄嘌呤(前体)3 g/L,可使腺苷产量大幅度提升,产量最高达到31.1 g/L,相比于原配方工艺腺苷产量(22.3 g/L)提高了39.46%。

常压室温等离子体和紫外诱变选育腺苷高产菌株

腺苷是一种内源性核苷类物质,在生理生化过程中起着重要的调控作用。使用常压室温等离子体(ARTP)诱变、UV-LiCl诱变和复合诱变,将诱变后的菌株涂布在含最低致死浓度的6-巯基嘌呤(6-MP)抗性平板和不含该抗性的平板上,35℃培养1~2d后对其抗性正突变株进行发酵筛选和传代稳定性考察,获得1株腺苷高产菌株A-Z-L-2,传代6次后其腺苷产量达到20.512g/L,较出发菌株BS-0腺苷产量提高了16.12%,且该菌株具有较好的传代稳定性。

枯草芽孢杆菌产腺苷补料发酵工艺的研究

目的:本文采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为发酵菌种,考察发酵液中次黄嘌呤前体物质的质量浓度与发酵产率的关系、次黄嘌呤前体物质加入方式与腺苷产量的关系,以研究提高腺苷发酵水平的补料发酵工艺。方法:利用摇瓶、50 L发酵罐、10 m³发酵中试罐,整合补料与溶解氧的发酵过程调控,进行逐级放大试验。结果:在10 m^(3)中试发酵罐进行补料工艺放大,流加补糖含9 g·L^(-1)的次黄嘌呤,并通过阶段控制溶氧条件,腺苷产量达到35.06 g·L^(-1)。结论:次黄嘌呤的添加对腺苷的生物合成有促进作用,分阶段溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺腺苷产量有明显的优势,腺苷补料发酵工艺的研究为工业化应用提供参考。

ARTP诱变选育高产腺苷菌株及发酵条件优化

为获得高产腺苷菌株,实现降本增效,该研究基于一株腺苷产生菌枯草芽孢杆菌SB-37,对其进行ARTP诱变选育,采用单因素实验和响应面方法优化菌株发酵条件。结果表明,最佳处理时间为30 s,菌株诱变致死率为98.75%。比对初始菌株腺苷产量,获得8株高产腺苷突变株,其中菌株Q40-2-37腺苷产量最高,为6.20 g/L,是出发菌株的2.58倍。该菌株最适发酵条件为葡萄糖99 g/L、蛋白胨25 g/L、pH 7.04、接种量8.03%、发酵时间72 h,此条件下,腺苷产量为6.92 g/L。该研究结果为高产腺苷菌株的诱变选育和发酵条件的优化提供了技术支撑。

过表达purA基因对腺苷积累的影响

利用穿梭质粒pBE43,在腺苷产生菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XGL(Xan-+Deam-+8-AGr+SGr)中过表达腺苷生物合成途径中关键酶腺苷酸琥珀酸合成酶(ADSS)的基因purA,研究其对腺苷积累的影响。以腺苷产生菌XGL基因组为模板,扩增出purA基因,将其连接到穿梭载体pBE43上,获得重组质粒pBE43∶∶purA。将重组质粒转化入XGL中,构建新的产生菌XGL-SY。通过逆转录PCR和定量PCR测定purA基因在腺苷产生菌XGL和XGL-SY中的转录量,并利用5L罐发酵实验测定发酵参数的变化。分析发酵对数期的基因转录发现,在添加质粒后,purA基因的转录量提高了约9倍。上罐实验表明改造后的产生菌XGL-SY,菌体生长虽然受到一定的影响,但在相同发酵周期内腺苷产量提高了10.8%。研究结果表明在腺苷产生菌中过表达purA基因可以促进腺苷的积累,这为腺苷工程菌的进一步改造奠定了基础。

枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的修饰对腺苷积累的影响

【目的】研究嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因的共同过表达对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响。【方法】利用温敏质粒pKS1,以单交换的形式增加了purF基因在基因组上的拷贝数,同时将强启动子P43插入嘌呤操纵子中,使嘌呤合成途径中purF基因及其下游purM、purN、purH和purD基因的表达水平得到加强,通过实时定量PCR(Realtime Quantitative PCR,RT-qPCR)测定相关基因(purF、purM、purN、purH和purD)的转录水平;通过酶活性检测分析关键酶基因扩增对PRPP转酰胺酶活性的影响;通过发酵实验考察出发菌株与工程菌株的生长、耗糖和腺苷积累情况。【结果】实时定量PCR结果表明,purF、purM、purN、purH和purD基因的表达水平均有不同程度的提高,嘌呤合成途径中关键酶PRPP转酰胺酶的活性是出发菌株的2.4倍。摇瓶发酵实验发现工程菌腺苷产量较出发菌提高17.5%,糖苷转化率增加26.1%。5 L罐发酵实验表明,虽然工程菌的菌体生长受到一定的影响,但在相同发酵周期内腺苷产量比出发菌提高了9.7%。【结论】嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因转录水平的增强能够提高腺苷的产量,为通过代谢工程技术改造腺苷生产菌提供了理论依据和研究思路。