芽孢杆菌(Bacillus subtilis No.16A)苎麻脱胶聚半乳糖醛酸裂解酶的纯化及酶学性质

通过丙酮沉淀,阳离子交换层析,凝胶过滤,从苎麻脱胶菌Bacillus subtilis No.16A发酵液中纯化了聚半乳糖醛酸酶（Pgase）.结果表明该酶分子量为30.2ku,最适作用pH为9.0,最适作用温度为50℃,在55℃以下、中性pH（6.0～8.0）范围内稳定, Ca^2＋、Mg2＋对该酶有激活作用, Cu^2＋、Mn^2＋、Co^2＋、Hg^2＋有抑制作用,酶解产物在235 nm处有强吸收峰,说明该酶是聚半乳糖醛酸裂解酶.

枯草芽孢杆菌A30菌株产生的拮抗肽的分离纯化与理化性质研究

平皿测试表明 Bacillussubtilis A30菌株对多种植物病原真菌 ,例如水稻纹枯病菌 (Rhizoctonia solani)、稻瘟病菌 (Magnaporthegrisea)等有强烈抑制作用。在小区试验中 A30菌液对水稻纹枯病也表现出了较好的防治效果。 A30菌株培养液经硫酸铵沉淀、FPL C疏水色谱、HPLC反相色谱后 ,纯化得到一种拮抗活性物质 ,命名为 P1。 P1对热稳定 ,对蛋白酶不敏感 ;茚三酮反应呈阴性 ,用酸水解后茚三酮反应和双缩脲反应呈阳性。经 L C- ESI- MS分析初步判断 P1的分子量为14 76 .

枯草芽孢杆菌ZC-7中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

枯草芽孢杆菌ZC-7的发酵液,经离心分离得到粗酶液,再经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、SephadexG-75柱层析等步骤获得电泳纯的中性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量大约为42kDa。以酪蛋白为底物时,该酶的Km为5×10-3,Vmax为2.5×104μg/min,酶的最适作用pH为7.0,最适反应温度为55℃,在pH6.5～8.0,40℃以下较稳定,对1mol/Lh2O2具有一定的耐受性。EDTA、异丙醇和乙醇对该酶有抑制作用,Ca2+、Mg2+和Li+离子对其具有保护作用。

磷脂酰丝氨酸合成酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的表达

应用PCR技术从Escherichia coli K12 Sgal-(ExPASy P23830)中扩增到大小为1350bp编码磷脂酰丝氨酸合成酶的DNA片段,将其插入枯草芽孢杆菌诱导型表达载体pBES,获得重组质粒pBES-pss后转化Bacillus subtilis DB104。经蔗糖诱导后,该磷脂酰丝氨酸合成酶在Bacillus subtilis DB104(pBES-pss)中获得胞外分泌表达,SDS-PAGE分析发现目的蛋白分子量约为52kDa,酶联比色法检测酶活力为1.50U/ml,提高了磷脂酰丝氨酸合成酶的表达产量,为工业化发酵生产磷脂酰丝氨酸合成酶奠定了良好的基础。

枯草芽孢杆菌C-36纤维素酶的纯化及酶学性质

枯草芽孢杆菌C-36纤维素酶经硫酸铵、SephadexG-75、SephadexG-100分离纯化后,得到一个电泳纯的葡聚糖内切酶。SDS-PAGE结果表明,该酶分子量约为35kD。最适反应温度和pH分别为65℃和pH6.8,Zn2+、Pb2+、Fe3+对酶有抑制作用,Ba2+、Fe2+对酶有激活作用,在50℃,pH6.8条件下,酶对CMC-Na的米氏常数Km为0.34g/L,最大反应速度Vmax为0.17mg/(min.mL)。

枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶的纯化及酶学性质研究

对枯草芽孢杆菌BEM01菌株发酵液中的弹性蛋白酶进行了分离纯化,并研究了酶学性质。先后采用了硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和分子筛层析等方法,弹性蛋白酶的回收率为7.88%,纯化倍数为13.79,结合SDS-PAGE和分子筛层析确定该弹性蛋白酶是一单链蛋白,分子量约为31ku。对酶学性质的研究表明,该弹性蛋白酶属于含有Ca2+的金属蛋白酶类;其最适作用温度为50℃,具有良好的热稳定性;在硼砂-硼酸缓冲体系、Tris-HCl缓冲体系中酶最适反应pH分别为7.4和8.6,在pH8.0～11.0酶活力趋于稳定;10mmol/L的Ca2+有激活和稳定酶活作用,SDS和吐温-80也有激活酶活作用,而Li+、Na+、Zn+、K+、Ba2+、Mg2+、Mn2+和EDTA对酶活均有不同程度的抑制作用;其催化动力学方程为:y=0.186x+32.493;V=0.0308U/mL,K=0.0057g/mL。

一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质

利用乙醇分级沉淀(37.5%～60%)、SephadexG75凝胶过滤、Phenylsepharose6FF疏水色谱三步分离使一种枯草芽孢杆菌氨肽酶得到纯化,比活1.5567×106U/mg;SDSPAGE鉴定为纯酶,分子质量75ku,全酶含2个亚基。纯酶最适温度60℃,温度稳定范围20～70℃。最适pH8.5,pH稳定范围8.0～10.0。Zn2+、Ni2+有较大的抑制作用,Co2+则对酶活有较强的激活作用。酶活性中心可能结合了2个Zn2+,米氏常数Km为1μmol/L,最大反应速度Vmax为5000μmol/(L·min)。

枯草芽孢杆菌WD-23 β-甘露聚糖酶的纯化及其酶学性质

利用硫酸铵盐析缓冲液透析、聚乙二醇浓缩、DEAE-Sepharose FF窝子交换层析等方法，纯化了枯草芽孢杆菌WD-23β-甘露聚糖酶，并研究了其酶学性质。结果表明：纯化的枯草芽孢杆菌WD-23β-甘露聚糖酶的分子质量约为40 ku，酶的纯化倍数为14.1倍；最适反应pH和pH稳定范围分别为5．6和5．0～7．0；最适反应温度和温度稳定范围分别为55℃和40～70℃；Ca2＋对该酶的促进作用最为明显，Li＋的抑制作用最明显。

内生枯草芽孢杆菌B-001菌株抗菌肽纯化与性质

An antagonistic peptide,H16,produced by endophytic Bacillus subtilis B-001 was purified via ammonium sulphate precipitation,DEAE-Sepharose FF chromatography,FPLC Phenyl FF chromatography and HPLC C18 chromatography.The peptide showed strong antagonistic activity to Ralstonia solanacearum.LC-ESI-MS analysis showed molecular weight of the peptide was 7 367.4 Da,which was the same with that by SDS-PAGE.It was thermostable and not sensitive to proteinases.

草鱼肠道一菌株产纤维素酶的分离纯化及性质研究

从草鱼肠道分离出1株枯草芽孢杆菌,有较强的活性。该菌产生的纤维素酶粗酶液,经盐析、透析,并通过葡聚糖凝胶层析柱SephadexG-75分离纯化,经SDS-PAGE后表明第2峰已纯化,得到一种相对分子质量约为62.43kD纤维素酶。分离纯化后该酶的比活力提高了2.924倍,回收率为6.38%。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH值为7.0;Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为1.02×10-3g/mL、2.727×10-2mg/(mL·min)。

重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化及酶学性质研究

利对重组枯草芽孢杆菌（pBES-pss）表达的磷脂酰丝氨酸合成酶进行分离纯化及酶学性质研究。pBES-pss发酵后的粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、SP—SepharoseHP离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析。基本获得电泳纯的重组磷脂酰丝氨酸合成酶，比活力可达13．62U／mg，分子量约为53kD。酶学性质研究表明，该酶催化卵磷脂水解反应的最适pH8．0，最适温度为35℃。稳定性研究表明：该酶在pH6．5～9．5区间和低于45℃温度下稳定。表面活性剂及金属离子对该酶水解活性的影响结果表明，SDS、Tween20、Tween80对该酶有抑制作用，Triton X-100对该酶有增强作用；Mg^2＋、Zn^2＋、K^＋对该酶有抑制作用，Ca^2＋、Mn^2＋和EDTA对该酶有增强作用。

枯草芽孢杆菌HS18碱性蛋白酶分离纯化及其性质研究

从合浦珠母贝肠道中分离鉴定到酶菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HS18,将枯草芽孢杆菌HS18的发酵液,经过硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A-50柱层析、Sephadex G-100柱层析3步纯化后得到了单一的酶蛋白,回收率为11.4%;经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得酶蛋白分子量约为31ku;该蛋白酶最适反应温度为50℃,最适pH10.0;K+及Na+对酶有明显激活作用;丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂(PMSF)能强烈抑制酶活性。表明所纯化到的蛋白酶为丝氨酸碱性蛋白酶。

磷脂酶D在枯草芽胞杆菌中表达及酶法催化合成磷脂酰丝氨酸的研究

磷脂酰丝氨酸(PS)因具备改善记忆、缓解精神压力等作用,常被应用于功能性食品和药物生产中.相比于提取法,以磷脂酶D(PLD)催化转酯反应合成PS具有更为环境友好、安全高效、易于操作等优点.本研究利用枯草芽胞杆菌表达并分泌来源于郝氏链霉菌(Streptomyces halstedii)TCCC21102的PLD,转酯酶活力达2.53 U/mL;经酶学性质分析表明,其最适温度为40℃、最适pH为5.5;利用该PLD在构建的单水相体系催化大豆磷脂酰胆碱(PC)合成PS,当反应24 h时PS产率达到最高,为42.6%.本研究为酶法制备新食品原料PS,实现其在功能性食品和制药行业中的应用奠定了基础.

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达载体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α–淀粉酶基因amy在B.subtilis DB403中的高效表达,活力达到770,U/mL.经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35.8,U/mg,纯化倍数为1.7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,重组酶AMY相对分子质量为4.8×104.对酶学性质进行分析,重组酶AMY的最适反应温度为60,℃,最适反应pH为6.0.

枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶的酶学性质研究

从 118 份样品中分离到 1 株产植酸酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,WHNB02),其发酵液经乙醇沉淀、硫酸铵分级沉淀及Sephadex G-100柱层析等步骤后分离纯化了该酶,纯化倍数约为 31.5 倍,回收率为13.0%.该酶为单体酶,SDS-PAGE测得的分子量约为 43 ku,以植酸钠为底物的K-m值为 0.5 mmol/L,酶反应的最适温度为 60 ℃,80 ℃作用 10 min酶活保存61%,最适pH为 7.0,在pH 6.0～10.0 范围内稳定,酶活性及稳定性都需Ca2+存在.EDTA、Mn2+、Ba2+(5 mmol/L)对酶活具有很大的抑制作用.

枯草杆菌6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的分离纯化及部分性质研究

采用DEAE Sepharose离子交换层析,Blue SepharoseCL 6B特异结合层析和SephadexG 200凝胶过滤技术,对枯草芽孢杆菌中的6 磷酸葡萄糖酸脱氢酶进行了分离纯化.纯化倍数为112.3倍,比活为1.46U/mg,回收率为8.2%.纯化酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳检验为单一带.测得全酶相对分子质量为107kD,具有两个分子量相同的亚基,亚基相对分子质量为51kD.最适pH值为8.0,最适温度为30℃,对热不稳定.以6 磷酸葡萄糖酸和NADP+为底物,其Km值分别为Km1(NADP+)=19.8μmol/L和Km2(6 GPA)=22.6μmol/L.在5mmol/L～50mmol/L浓度范围内,Mg2+,Ca2+和Mn2+对酶有激活作用,Fe3+和Cu2+对酶有抑制作用,K+,Na+,Cl-,NO-3,SO-4对酶几乎没有影响.用PMSF,TNBS,NBS,DTT和BrAc对酶进行修饰,实验结果表明,丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和组氨酸残基可能是该酶活性中心的功能基团.

苹果霉心病生防菌株抗菌蛋白的提纯与部分性质初报

对苹果霉心病具有优良防治效 果的枯草芽 孢杆菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ （ Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ） Ｃｏｈｎ） Ｘ Ｍ１６ 菌株，是作者从莱阳农学院农场苹果树上分 离得到的一种拮抗菌株。 Ｘ Ｍ１６ 菌株培养液经硫酸铵分 级盐析和 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ １００ 及 Ｄ Ｅ３２ 柱层析后，分离纯化得到一种抗 菌蛋白。该抗 菌蛋白通过 Ｓ Ｄ Ｓ－ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ分析测定的分子 量 为６００００ ，等 电点 约为 ５ ．５ ， 偏酸 性； Ｘ Ｍ１６ 菌 株抗 菌蛋 白对 １００ ℃以 上高 温稳 定。 Ｘ Ｍ１６ 菌株抗菌蛋白对１０ 种测定的病原真菌，均具有良好的抑 制作用，表明其抗菌的广谱 性。此 抗菌蛋白对 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ 等真菌病原的抑菌机理主要 表现为： 抑制病菌孢子萌发，使孢 子发芽异常；使菌丝畸变，细胞壁溶解，原生质泄漏。

椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21产β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质研究

[目的]分离纯化来源于内生枯草芽孢杆菌YZ-21的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质.[方法]采用乙醇沉淀法、硫酸铵盐析法、聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH 4)2SO 4]双水相体系进行分离与纯化,在此基础研究它的酶学性质.[结果]比较3种纯化方法,最优方法为双水相萃取法,在双水相体系为16%(NH 4)2SO 4、18%PEG2000、2%NaCl条件下,纯化倍数最高可以达到3.06,酶回收率达到99.26%;酶学性质研究表明,β-甘露聚糖酶的最适反应pH为7.0,最适的反应温度是40℃,pH稳定性在3.0~7.0,热稳定范围在35~55℃之间;Ca^2+,Ba^2+,Mg^2+,K^+,Co^2+对酶都有激活作用,而Ca^2+激活作用最强,Cu^2+,Na^+,Zn^2+,Mn^2+,EDTA对酶有抑制作用.[结论]利用双水相萃取法较好纯化了β-甘露聚糖酶,酶学性质良好,可以广泛应用于饲料添加剂、纸浆漂白和食品加工等领域.

枯草芽孢杆菌酸性内切葡聚糖酶的分离纯化及酶学性质

将来源于藏猪粪便的枯草芽孢杆菌BY-4菌株接种于含4%麸皮的产酶培养基中,37℃、220r/min培养48h,发酵上清液经HiTrap Phenyl HP疏水作用层析、HiPrep 16/60Sephacryl S-100凝胶过滤层析分离纯化得到一个内切葡聚糖酶组分,纯化倍数为15.5,回收率为25.0%。经SDS-PAGE、酶谱分析鉴定,两步分离纯化后为电泳纯的纤维素酶,相对分子量约为55 000。酶学性质研究表明,该酶的最适反应pH为4.5,最适反应温度为60℃。Mg2+、Zn2+对该酶有一定的激活作用,而Mn2+、Co2+、Ag+对该酶产生了抑制作用。