转枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillus subtilis fibrinolytic enzyme,BSFE)基因对烟草生长发育的影响

将枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillussubtilisfibrinolyticenzyme,BSFE)基因及其信号肽序列转入烟草,转基因烟草表现出不同于野生型烟草的生长特性,如营养器官生长速率下降、叶片数目减少、叶片狭长、叶片宽度/叶片长度值降低以及植株矮小、节间缩短等。推测其与外源BSFE的蛋白水解活性有关。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ3-2发酵薏米高产川芎嗪和溶纤酶体系优化

前期初探发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ3-2发酵精薏米可高产川芎嗪[2.97 mg/g干基(dry weight,DW)]和纤溶酶(720.84 U/g)。该研究以糙薏米、精薏米和碎薏米为原料,以B.subtilis BJ3-2为发酵菌株,通过单因素及Box-Behnken试验构建高产川芎嗪和溶纤酶的薏米发酵体系。结果表明,接种量为9.0%、发酵温度为40℃和发酵时间为93 h时,B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米中川芎嗪产量为6.15 mg/g DW、溶纤酶酶活为2236.47 U/g,而以接种量为8.1%、发酵温度为38℃和发酵时间为96 h时,发酵精薏米中川芎嗪产量为6.94 mg/g DW、溶纤酶酶活为2142.18 U/g,但碎薏米中川芎嗪产量和溶纤酶酶活均明显偏低。此外,B.subtilis BJ3-2分别发酵的3种薏米,其川芎嗪含量均高于B.subtilis BJ3-2发酵黄豆和CICC 20637发酵薏米。因此,综合考虑加工成本,B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米可作为高产川芎嗪和溶纤酶的最佳发酵体系。

3种渗透剂对转基因烟草根系枯草芽孢杆菌纤溶酶(BSFE)分泌的调节

用0.05%～8.00%的甘露醇、山梨醇和聚乙二醇6000等3种渗透调节剂可提高转枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillussubtilisfibrinolyticenzyme,BSFE)转基因烟草(NicotianatabacumL.)根系BSFE的分泌表达水平,其水培液BSFE活性在15d内基本呈抛物线型变化趋势。经3种渗透剂处理后转BSFE基因烟草水培液的BSFE活性峰值明显高于对照,且出现时间比对照相对延迟1-2d。甘露醇、山梨醇和聚乙二醇6000可作为该转基因烟草根系BSFE分泌表达的有效化学调节剂。

紫外线诱变选育高产豆豉纤溶酶菌株及其产酶条件优化

该研究以分离自豆豉样品中产豆豉纤溶酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DC-1为出发菌株,采用紫外线诱变选育高产豆豉纤溶酶且稳定遗传的菌株,并以豆豉纤溶酶活力为评价指标,通过单因素试验及正交试验对其发酵条件进行优化。结果表明,筛选出一株高产豆豉纤溶酶活力且稳定遗传的诱变菌株DC-V5,其最优发酵条件为:接种量3%、装液量70 mL/250 mL、发酵温度34℃、初始pH 6.5。在此优化发酵条件下,诱变菌株DC-V5产豆豉纤溶酶活力最高达到(451.26±11.09)IU/mL,是优化前出发菌株DC-1的1.74倍。

枯草芽孢杆菌纤溶酶基因在转基因烟草组织中的分泌表达

克隆枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillussubtilisfibrinolyticenzyme,BSFE)基因及其前导肽序列。通过农杆菌EHA105介导转化,获得转基因烟草植株。其BSFE的表达水平为叶片42.97±28.59U·g-1FW、茎15.14±10.57U·g-1FW和根25.55±14.71U·g-1FW。其内源BSFE信号肽可在转基因烟草中行使蛋白转运功能,使BSFE具有分泌表达特性。这一系统可用于建立利用植物组织分泌表达外源蛋白的系统模型。

枯草芽孢杆菌BS-26菌株纤溶酶的性质分析及活性组分的分离纯化

【目的】溶栓疗法是血栓性疾病安全且有效的治疗手段,从微生物中寻找溶栓药物是一种理想有效的途径,枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BS-26菌株发酵液具有很强的体外纤溶活性,本文分析了发酵液中纤溶酶的性质并对活性组分进行了分离纯化。【方法】利用纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性,利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和聚丙烯酰胺制备电泳等方法,进行分离纯化。【结果】此菌株产生的纤溶酶在50℃以下和pH5.0~11.0范围内具有较好的稳定性,最适作用温度为42℃;最适pH值为9.0;Mg2＋、Ca2＋对此酶有明显的激活作用,而Cu2＋能完全抑制酶的活性;174.2μg/mL的苯甲基磺酰氟、1000μg/mL的鸡卵类粘蛋白和1000μg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂能完全抑制酶活性,初步说明此酶属于丝氨酸蛋白酶类;体外溶纤作用表明,该酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。从该菌株的发酵液中获得了一种纤溶酶组分,比活力达8750U/mg,回收率为3.2%,所获得样品纯度相对于发酵液提高了41倍,该酶在SDS-PAGE中是单肽链蛋白,分子量为32kDa。【结论】获得了一种纤溶酶的单一组分,为纤溶酶发酵产品的大规模纯化及进一步研制和开发新的溶栓药物提供重要理论依据。

豆豉纤溶酶在枯草杆菌WB800中的高水平表达(英文)

一个来源于豆豉产生菌DC12的新的纤溶酶基因序列被克隆测序.为了实现在枯草杆菌中高水平表达豆豉纤溶酶,将来源于枯草杆菌168的重叠启动子P43序列以及转录终止信号序列通过重叠延伸融合,将融合序列克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3中,构建了pBEP43载体.将豆豉纤溶酶基因插入到载体pBEP43后转化枯草杆菌WB800.结果表明,在P43启动子驱动下,豆豉纤溶酶基因在重组菌中的对数生长期和平衡期均获得了表达且分泌到培养基中.重组菌经培养后上清液中的纤溶酶活性最高达1270U/mL,是豆豉纤溶酶基因在自身启动子驱动下表达量的1.87倍和野生菌株枯草杆菌DC12表达量的4.1倍.

豆豉纤溶酶产生菌的筛选及菌种鉴定

在收集的全国 2 1个豆豉产品中分离到 36 9株革兰氏阳性芽孢杆菌 ,对其进行产纤溶酶活性筛选 ,得到 1株高产纤溶酶菌株HGD10 7。对菌株HGD10 7进行形态、生理、生化鉴定 ,初步鉴定为枯草芽孢杆菌。

产纤溶酶海洋枯草芽孢杆菌的发酵工艺研究

对一株产纤溶酶的海洋枯草芽孢杆菌LJ-22的固、液体发酵条件分别进行了优化,确定该菌株的最佳液体发酵条件为温度31℃,初始pH7.0,转速180r/min,接种量4%,培养时间72h,最佳固体发酵条件为温度34℃,初始pH7.0,接种量10%,装样量10g,静置培养时间72h。在上述条件下,菌株LJ-22的液体发酵产纤溶酶酶活为(830±12.5)IU/mL,是优化前的1.69倍,固体发酵产纤溶酶酶活为(4300±12.8)IU/g,是优化前的1.56倍。通过比较固、液体发酵条件及产酶酶活,得出该菌株更适合液体发酵,便于大规模工业生产。

枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达

为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL.

一株产纤溶酶菌株BS-26的分离和鉴定

目的对纤溶酶产生菌株进行筛选和鉴定。方法采用LB-纤维蛋白平板初筛和摇瓶发酵复筛的方法进行筛选;通过对菌株形态和生理生化特征以及16S rDNA进行鉴定。结果从土壤中分离得到5株纤溶酶高产菌株,其中菌株BS-26活性最高。其形态和生理生化特征与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)很相近。将所测得的16SrDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库进行相似性分析,并用Neighbor-Joining法构建系统发育树。BS-26菌株与Bacillus subtilis的相似性达到99.63%。结论BS-26菌株鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

产纤溶酶枯草芽孢杆菌发酵条件的研究

本实验室筛选到一株产纤溶酶较强的枯草芽孢杆菌,通过研究发现,其最适产酶的发酵条件为:葡萄糖2%、豆渣6%、pH7.0、温度37℃、种龄24h、接种量10%。发酵第4d产酶最高,最大产酶量可达713.11IU/mL。

一株高活性豆豉纤溶酶产生菌的筛选及其酶活的测定

在收集的全国14个豆豉产品中分离到36株革兰氏阳性芽孢杆菌,利用人工血纤维蛋白平板对其进行产纤溶酶活性筛选,得到一株高产纤溶酶菌株GZ-A1,经形态鉴定初步鉴定为枯草芽孢杆菌。筛选的菌种通过8h种子液的培养,接入发酵液中发酵72h后,发酵液经4℃、9000r/min离心15min,取上清液加到人工制备的纤维蛋白平板上,37℃恒温培养18h^36h以后,通过测定纤维蛋白平板上透明溶解圈的直径大小来确定所产纤溶酶的酶活大小,进一步确定高活性纤溶酶的产生菌株。

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达

以实验室筛选的UD8豆豉芽孢杆菌的总DNA为模板,应用PCR技术根据豆豉纤溶酶基因DNA序列(GeneBank AY720895.2)设计并合成1对引物,扩增出了豆豉纤溶酶基因,将该基因克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒EC-BS8上,构建成表达质粒EC-BS8,再将其转化到枯草芽孢杆菌Bs6中。筛选表达菌株,实现了豆豉纤溶酶基因在枯草杆菌中高效表达。获得重组菌纤溶酶活力高达9 830 IU.mL-1,是出发菌株活力的2.9倍。经纯化SDS-PAGE鉴定重组豆豉纤溶酶相对分子质量为31.0 kDa。

豆豉纤溶酶的定向进化

为提高豆豉纤溶酶的药用价值,通过易错PCR方法对来源于Bacillus subtilis DC-12的豆豉纤溶酶DFE基因进行突变并构建突变体文库,利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA对突变体文库进行筛选.通过3轮易错PCR最终获得催化效率提高的突变酶mDFE3.序列分析表明突变酶mDFE3基因发生了6处碱基突变,其中4处突变发生氨基酸取代,2处为同义突变;通过swiss-model repository模拟突变酶mDFE3的结构,显示3个突变氨基酸位于回环结构上,1个位于α螺旋上;酶动力学测定结果表明突变酶mDFE3的Km值由0.58mmol/L降低至0.45mmol/L,突变酶mDFE3的催化效率(kcat)是野生型的2.57倍.

两步固态发酵法酿造功能性豆豉

运用分离自云南传统发酵豆豉的Bacillus subtilis SP-8-5与Lactobacillus plantarum YM-5-2菌株对大豆进行两步固态混合发酵。首先,将菌株B.subtilis SP-8-5接种至经室温浸泡10 h(20℃,质量比为1∶3),110℃(20min)蒸煮处理并冷却至30℃的大豆中,于26℃进行初步发酵42 h;随后再接种L.plantarum YM-5-2,并于30℃发酵2 d,最后置于4℃进行后发酵。经两步固态混合发酵处理后,得到一种纤溶活性较强,生产周期短,保质期相对较长,风味独特且易于被大众接受的新型功能性发酵豆豉。当后发酵时间为21 d时,样品豆豉中B.subtilisSP-8-5活菌数为(5.88±0.53)×108 CFU/g,而L.plantarum YM-5-2活菌数则高达(3.50±0.35)×1011 CFU/g,此时检测豆豉纤溶酶的纤溶圈直径高达(2.99±0.06)cm(37℃,静置培养48 h)。

纳豆激酶的研究进展

纳豆激酶是由纳豆菌代谢产生的具有高效溶栓效果的纤维蛋白。它具有溶栓作用强、体内半衰期长、安全性好和口味易接受等优点。该文对纳豆激酶的溶栓效果同传统溶栓类药物进行了对比,并对纳豆激酶的作用机理、理化性质、稳定性、检测方法、相关产品生产现状以及新型含有纳豆激酶的发酵食品的研发进行了综述。

豆豉中5株产纤溶酶菌的筛选与鉴定

采用酪蛋白平板初筛的方法,从全国14种纳豆和豆豉中分离到39株具有蛋白酶活力的菌株;又以猪血粉平板进行复筛,并采用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活力,得到5株产纤溶酶能力较强菌株,分别命名为CQDC-03、CWND-03、NCDC-02、YJND-01和FJDC-02。对其进行16S r DNA序列分析,结果表明:CWND-03、CQDC-03和Bacillus subtilis相似性为99%,NCDC-02和Bacillus subtilis相似性为98%。因而CQDC-02、CWND-03和NCDC-02认定为Bacillus subtilis,YJND-01和FJDC-02是否为Bacillus subtilis的新种还有待进一步鉴定,但确定其为Bacillus属。

产纤溶酶菌株的分子鉴定及其液体产酶特点分析

通过对实验室分离筛选出的2株产纤溶酶能力较强的细菌菌株进行16S rRNA碱基序列测定,并与已发表的16S rRNA序列进行对比分析,确定2个菌株均属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).在此基础上,对2个菌株液体发酵产纤溶酶的特点进行了对比分析.实验结果表明,2个菌株适宜的发酵产酶时间均为60～108 h.在优化的液体发酵条件下,2个菌株单位发酵液中纤溶酶平均产量可分别达到773.07 U/mL(菌株1)和962.28 U/mL(菌株2).

产纤溶酶枯草杆菌液体发酵工艺优化研究

采用单因子实验和正交实验对高产纤溶酶的枯草杆菌最佳发酵工艺进行了优化 ,结果表明 ,该菌株分泌的胞外酶具有较强的体外溶栓作用 ,产纤溶酶最佳的发酵条件为 :3%可溶性淀粉 ,2 %豆浆全汁 (鲜豆 ) ,0 .0 2 %CaCl2 ,培养温度为 37℃ ,初始pH8.3,装液量为 2 5 0mL三角瓶 5 0mL ,发酵时间 4 4h左右 ,Ca2 + 、Mg2 + 和Mn2 + 对酶活力有促进作用 ,Cu2 + 对酶活性有强烈抑制作用。