苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因穿梭质粒的构建

在农业生产中长期使用化学农药已对环境和生态平衡造成一定破坏作用,同时有不少害虫也逐渐产生抗药性从而引起某些害虫的大流行,给农业生产带来巨大损失。应用苏云金杆菌杀虫蛋白基因(Bt基因)可构建具有抗虫作用的抗虫工程菌,这样通过拌种或植物叶面喷雾可达到快速、经济、有效的防治虫害的目的。国际上抗虫工程菌研究应用很快,如美国将BI基因转入到一种正常情况下定居在植物组织中的棒杆菌,将这种工程菌拌玉米种子,这样随植物生长该菌在植物体内大量繁殖,当玉米螟在茎和叶取食时,即因食用表达苏云金杆菌毒蛋白的工程菌而死亡。 田颖川等已克隆了苏云金芽孢杆菌内毒素基因CryIA(b)和CryIA(c)。本文将Bt基因CryIA(c)插入到大肠-枯草穿梭载体pBE-2中构建成Bt毒蛋白基因穿梭质粒pAMY,利用电穿孔法转人大肠杆菌DH5a,枯草芽孢杆菌B.subtilis BR151,IA511,野生型蜡状芽孢杆菌B.cereusa-47,短芽孢杆菌B.brevis A-5和枯草芽孢杆菌90-8,获得了具有较高杀虫活性的工程菌克隆。

大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4的构建

作者用ＤＮＡ重组技术，构建了大肠杆菌－枯草杆菌穿梭质粒载体ｐＳＵＧＶ４，它是以大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）质粒载体ｐＵＣ１８为骨架，与来自穿梭质粒表达载体ｐＲＥＰ９含有革兰氏阳性菌复制起点（ｏｒｉ＋）和卡那霉素抗性（ｋａｎｒ）基因片段重组而成．上述穿梭质粒载体可用于在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）和枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中进行基因克隆工作．

B.thuringiensis穿梭载体的构建及cry1C基因的表达

以pUC19为母体，克隆了Btken－Ag（B.thuringiensissubsp.kenyaeAg）的复制起始区（～1．6kb）和pUC4K的aphⅠ基因，构建成穿梭载体pHV－1。pHV－1在E.coli中经100个世代，质粒保持率在80％以上；5在Bti4Q8（B．thuringiensissubsp.israelensis4Q8）中经40个世代，质粒保持率在80％以上。将B．licheniformis热稳定α－淀粉酶基因启动子控制下的Bt9510（B．thuringiensis9510）的crylC结构基因插入pHV－1，构建成重组质粒pHV－crylC，电激转化导入Bit4Q8。光学显微镜下观察，Bit4Q8无晶体产生；而Bit4Q8（pHV－crylC）则出现典型的菱形晶体，其晶体略小于Bt9510。生物测定结果表明表达的Cry1C蛋白对甜菜夜蛾具有一定的毒杀活性。

利用血红蛋白基因提高短小芽孢杆菌在低氧条件下的碱性蛋白酶产量

将透明颤菌血红蛋白基因vgb成熟肽编码区序列分别与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）P43双启动子和短小芽孢杆菌（B. pumilus）碱性蛋白酶基因启动子wBp连接,利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4分别构建组成型表达质粒pSUP43Vgb和pSUwBpVgb,将其分别转化短小芽孢杆菌UN-31-C-11.SDS-PAGE和CO差异光谱检测表明,融合基因在UN-31-C-11中均得到了表达,并且表达质粒使重组菌株在低氧条件下的生长量在对数生长后期超过对照菌株20%以上,同时促进了短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的表达,其产量高于对照30%以上.

枯草芽孢杆菌绿色荧光蛋白高效表达载体的构建

利用绿色荧光蛋白基因gfpmut3标记枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的启动子P43;构建1个枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pP43GFP。结果表明:P43与gfpmut3构成了融合基因,可调控gfpmut3在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中的表达;荧光检测发现,P43在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中具有极强的启动基因表达能力;质粒稳定性测定表明,连续稀释培养55 h后,质粒的稳定性为85%。

Bt4.0718 cry1Ac基因的克隆与表达分析(英文)

在基因库中比对14种cry1Ac基因序列,发现了同源性很高的上游启动子区域和下游终止子区域。根据这一同源序列设计引物,从B t4.0718中扩增出包含双启动子和终止子的4.2 kb片段,用PCR-RFLP检测确定其中含有cry1Ac基因。然后将此片段克隆到穿梭载体pHT304中,转化大肠杆菌DH5α和B t无晶体突变株XZM-101。同时,利用原子力显微镜观察发现重组菌株BXZM34能够产生菱形晶体。

GFP为外源报告基因在地衣芽孢杆菌20386中表达的研究

目的 探讨外源基因在野生型地衣芽孢杆菌 2 0 386中表达的可行性。方法 利用大肠杆菌 枯草芽孢杆菌穿梭表达载体在大肠杆菌DH5α中构建含绿色荧光蛋白 (GFP)基因的重组质粒 ,通过电转化将重组质粒转入到野生型地衣芽孢杆菌 2 0 386中表达 ,通过检测绿色荧光蛋白的存在 ,考察该野生型菌株表达外源基因的可能性和表达能力。结果 在紫外光激发下 ,在固体LB平板上生长的菌落能显示绿色荧光 ,而在液体LB培养基中培养的菌体和培养上清中未能检测到绿色荧光蛋白的存在。结论 外源基因在野生型地衣芽孢杆菌 2 0 386中能够表达 ,但在液体LB中培养时 ,可能会被该菌自身分泌的蛋白酶分解 ;亦可能被稀释而无法测到荧光 。

芽孢杆菌外毒素保护性抗原与上游强启动子穿梭载体的构建

目的构建携带炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)的两种穿梭载体与上游强启动子。方法将解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子克隆到载体pbluescript-sk(+)上,构建载体pBLKSP;以A16R疫苗株(Tox+,Cap-,弱毒株)DNA为模板,设计合成内外侧引物巢式PCR扩增获得保护性抗原(PA)的全基因,先克隆到载体pBLKSP,再将其和质粒PUB110重组构建成两种穿梭载体。结果酶切鉴定显示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论成功构建了带有强启动子的两种穿梭载体。为在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和炭疽芽孢杆菌的分子疫苗研究奠定了基础。