电脉冲法转化苏云金芽孢杆菌BMB171的研究

研究了用电脉冲法转化苏云金芽孢杆菌受体菌ＢＭＢ１７１的优化条件以及由转化导入的几类ｃｒｙ基因在ＢＭＢ１７１中的表达效果。结果表明，采用ＳＧ溶液作电脉冲缓冲液，用１０．ｏｋＶ／ｃｍ的脉冲场强和１次电脉冲（４．６ｍｓ）以及采用对数前期（ＯＤ６５０ｎｍ为０．２～０．３）收获的受体菌，可以达到最高转化频率，其中用ｐＨＴ３１０１电转化 ＢＭＢ１７１的最高频率达 ８×１０７转化子／μｇ ＤＮＡ。转化频率随质粒ｐＨＴ３１０１浓度的增加，在５４．６９ｐｇ／ｍＬ至３．５０μｇ／ｍＬ范围内直线性增加，随后达到饱和。转入的几种外源质粒在ＢＭＢ１７１中可分别表达其携带的ｃｒｙｌＡｃ１０，ｃｒｙｌＡｂ，ｃｒｙｌＣａ和ｃｒｙ３Ａａ基因，产生特征性的杀虫晶体蛋白，并形成典型的伴孢晶体。

苏云金芽孢杆菌高效菌株cry基因分析及多价基因组合的研究

对本室筛选的高活性Ｂ．ｔ．野生株进行了ｃｒｙ 基因检测，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明ｃｒｙＩＡｃ和ｃｒｙ１Ｃ位于质粒上．利用接合转移和电穿孔转化等方法对这些菌株进行了遗传改良研究．结果表明：高效野生株７４０４、ＨＤ－１－Ｘ和９５１０ 不易获得并表达外源ｃｒｙ 基因，而高效野生株Ｂｔｉ． ｔ－１８９７ 的电转化频率较高，并获得以Ｂｔｉｔ－１８９７ 为受体，对甜菜夜蛾、棉铃虫、黏虫和淡色库蚊均有毒力，具有ｃｒｙＩＡｃ、ｃｒｙＩＣ、ｃｒｙＩＶ及ｃｙｔ多价基因的广谱工程菌株．

苏云金芽孢杆菌菌株YBT1535转cry1C基因菌的构建

利用电脉冲将cry1C基因转入苏云金芽孢杆菌野生菌株YBT15 35 ,筛选得到 3个转化子。质粒电泳、PCR扩增及Southern杂交结果均证明 ,基因cry1C已转入菌株YBT15 35。生物测定结果表明 ,3个转化子对甜菜夜蛾的毒力比出发菌YBT15 35均有显著的提高 ,转化子YBT15 35 1和YBT15 35 3对小菜蛾和棉铃虫的生物活性与出发菌YBT15 35相近 ,而转化子YBT15 35 2则有一定幅度的提高。

电转化法及其在苏云金杆菌中的应用

苏云金杆菌（ Ｂｔ）工程菌的构建，可以采用原生质体融合、接合转移和转化等方法，其中电转化法被公认为是最有效的手段之一，此技术已广泛地应用于 Ｂｔ的遗传改良．本文阐述了电转化基本原理及基本操作步骤．此外。

苏云金芽胞杆菌菌株YBT833含不同杀虫晶体蛋白基因转化子的特性

用电脉冲方法将含有苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1C的重组质粒pBMBLC转入野生菌株YBT833，获得含不同杀虫晶体蛋白基因的4个转化子。质粒检测和Southern杂交证明它们均为菌株YBT833含重组质粒pBMBLC的转化子。PCR扩增表明，转化子YBT833-1保留了原有的杀虫晶体蛋白基因；转化子YBT833-2丢失了基因cry1Ab；转化子YBT833-3则丢失了所有的杀虫晶体蛋白基因。SDS朠AGE_检测表明，转化子YBT833-1和YBT833-2与YBT833一致，均有130kDa和65kDa蛋白带，而YBT833-3则只有130kDa蛋白带。生物测定显示，除转化子YBT833-2对小菜蛾毒性明显高于YBT833外，其余均比YBT833低。

消除内生质粒对苏云金芽胞杆菌YBT-1463特性的影响

研究了经完全消除苏云金芽胞杆菌野生菌株ＹＢＴ－１４６３的内生质粒对该菌部分形态、遗传及生理生化特性的影响。结果表明，消除内生质粒后的无质粒突变株不形成伴胞晶体，但电转化４种供体质粒，即ｐＢＭＢ１２１、ｐＢＭＢ３０４－１Ａｂ、ｐＢＭＢＬＣ和ｐＢＭＢ９７４８的效率显著提高，转化频率最高比出发菌株提高６．８×１０～４倍，而无质粒突变株对红霉素等１０种抗生素的敏感性、对葡萄糖等１９种碳源和谷氨酸等１２种氮源的利用能力及生长性能与出发菌株无明显差异。

苏云金芽胞杆菌高效电转化方法的建立

电转化已经成为苏云金芽胞杆菌工程菌构建过程中非常重要的一种外源基因导入方法.高效率的电转化方法将加速这类研究进展.通过对培养基、培养时间、感受态细胞制备、电转化缓冲液、电压参数的优化,建立一种高效的苏云金杆菌电转化方法.苏云金杆菌生长在含有0.5 mol/L山梨醇的BHI培养基中,30℃振荡培养至OD600值达到0.6～0.8,细菌细胞经1 g/L蛋白酶K在37℃处理20 min,然后用电转化缓冲液洗涤2遍,设定电压为1 800 V,电击1次.利用该方法,pHT315质粒在苏云金杆菌中的转化效率大幅提高.