Preparation of recombinant firefly luciferase by a simple and rapid expression and purification method and its application in bacterial detection

A simple and rapid expression and purification method of recombinant firefly luciferase was developed for bacteria detection. A modified luciferase gene from North American firefly Photinus pyralis was cloned into pET28a expression vector and the recombinant protein was produced in Escherichia coli BL21. The recombinant luciferase,equipped with a polyhistidine affinity tag,was purified by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). The approach generated an abundant expression and an efficient purification of a recombinant luciferase with final yield 1.995mg/L of cell culture. Experiments on the recombinant luciferase also showed that the relative light units (RUL) of the enzyme were 5.8×108,and the specific activity was 2.9×1010 RLU/mg. By applying adenosine triphosphate (ATP) bioluminescence to detection of the coin bacteria using the recombinant protein,the ATP content of bacteria was 9.48×10-16mol/mL,and was identical to the bacteria counts (4500CFU/mL) in order of magnitude. Taken together,our results provided a simple and efficacious method of the preparation of recombinant luciferase,which could be applied in the determination of bacteria via ATP bioluminescence.

基于生物发光技术的细菌总数快速检测仪

针对细菌总数现场检测需求，设计了一种基于ATP（三磷酸腺苷）生物发光技术的细菌总数现场快速检测仪。传统方法检测细菌总数需要2-3天，而利用ATP生物发光技术可在30min之内完成检测，大大提高了检测速度。本检测仪选取H5773-02型光电倍增管作为光电转换器件以检测微弱光信号，该光电倍增管的工作波长范围为330-850nm，峰值检测波长为500nm，ATP生物发光波长为550nm，两者基本一致，使检测仪具有较高的测量灵敏度。采用流动注射技术，在加入被测样品后分别向样品池中加入检测试剂。由于样品池被密闭在检测腔中，因此可有效减小外界光对测量结果的影响，同时也减小了人为加样对检测重复性的影响，提高检测重复性。利用本检测仪对浓度在10^-6-10^-14mol/L内的ATP样品进行了检测。实验表明，测量结果具有明显梯度，测试时间小于400s时，与标准样品浓度间的线性相关系数达到0.986。设计的细菌总数快速检测仪具有检测速度快、重复性高、操作简单等优点，可适用于食品卫生与安全、环境检测等领域。

细菌荧光酶生物发光分析法测定血清γ-氨基丁酸

利用γ－氨基丁酸酶偶联细菌荧光酶生物发光系统建立血清γ－氨基丁酸的微量分析方法。血清首先用０．５ｍｏｌ／Ｌ三氯乙酸溶液沉淀蛋白，再与双酶液混合，由全自动发光光度计记录发光峰值并计算结果。测定的线性范围达１０００ｎｍｏｌ／Ｌ，与高效液相色谱法比较，相关系数为０．９７６，不同含量的三份样品，批内变异分别为１１．２％、９．５％和８．３％，批间变异分别为９．１０％、１３．４％、１５．０％。

细菌荧光酶生物发光分析法测定血清中抑制性神经递质GABA

ｙ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）是一种主要的抑制神经递质，其含量的变化与许多神经和精神性疾病有关，本文报道了利用ＧＡＢＡ酶偶联细菌荧光酶生物发光系统建立的ＧＡＢＡ超微量分析方法。血清标本先经８０ｇ／Ｌ的三氯乙酸溶液沉淀蛋白，再与双酶工作液混和，由全自动发光光度计记录发光峰值和计算结果。本法的线性范围是０－１０００ｎｍｏｌ／Ｌ。与高效液相色谱法比较，ｙ＝０．９７６，不同含量的３份标本，批内变异分别为１１．２％、９．５％和８．３％，批间变异为１２．５％。本研究还初步探讨了ＧＡＢＡ对帕金森综合征的诊断价值。

ATP生物发光检测技术的建立及应用可行性分析

建立了测定食品中细菌总数的ATP生物发光检测技术,考察了各种理化因素对生物发光反应的影响。反应体系最优化条件:Ln浓度为70mg/L,FL浓度为50mg/L,Mg2+浓度为0.25mmoL/L,pH为7.2,最适温度为23℃。在10-10～10-15mol/mL范围内,ATP浓度与生物发光强度之间有较好的线性关系,相关系数R2=0.978。方法检出限为10-15mol/mL,批内变异和批间变异分别小于7%和8%。将建立好的ATP生物发光反应体系应用于食品样品中细菌总数的检测,加标回收率范围为82.2%～112.4%,检测结果与平板计数结果相关性良好。因此,建立的ATP生物发光检测技术用于检测食品中细菌总数是可行的。