产单核细胞李氏杆菌Lm4b_02325/26双基因缺失株构建及部分生物学特性试验

旨在构建食源性产单核细胞李氏杆菌毒力岛4(LIPI-4)中的抗转录终止子(Lm4b_02325)和未知蛋白(Lm4b_02326)基因的双缺失株,研究Lm4b_02325/26基因对产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)的部分生物学特性的影响。利用同源重组技术构建LM928ΔLm4b_02325/26双缺失株,测定LM928和LM928ΔLm4b_02325/26双缺失株在脑心浸出液肉汤(brain heart infusion broth, BHI)、不同EtOH浓度、不同NaCl浓度、不同pH、不同温度下的D_(600 nm),绘制生长曲线;RT-qPCR检测双基因缺失前后体外BHI培养环境下部分毒力因子转录水平;平板计数测定其对鼠巨噬细胞RAW264.7的黏附、侵袭与胞内增殖情况;感染C57BL/6小鼠后检测肝、脾、脑组织中的细菌数量。结果表明,成功构建具有遗传稳定性的双缺失株LM928ΔLm4b_02325/26。在含0.5%~10%NaCl或3%~4.5%EtOH的培养基中,双缺失株与野毒株生长没有明显差异,在pH=5条件下,双缺失株的生长率显著高于野毒株,pH=9条件下双缺失株的生长率显著低于野毒株。在不同温度(4℃、37℃、42℃)BHI培养基中,双缺失株与野毒株生长没有明显差异。Lm4b_02325/26基因双缺失株在BHI培养基中毒力因子hly、inlC和PlcA极显著上调(P<0.01),mpl、inlB、actA、inlP、PlcB、prfA、SigB、iap和inlA极显著下调(P<0.01);双缺失株对RAW264.7细胞的黏附率(14.86%)和侵袭率(2.23%)明显低于野毒株的黏附率(22.93%)和侵袭率(4.28%)(P<0.01);3、6、12 h时胞内增殖数量极显著低于野毒株(P<0.01);双缺失株与野毒株感染小鼠后,载菌量在肝、脾中没有显著差异,在脑组织中双缺失株载菌量为10~4,高于野毒株的10~(3.07),差异极显著(P<0.01)。综上认为,LIPI-4的Lm4b_02325和Lm4b_02326基因参与LM毒力因子的表达和脑组织的定植能力,与弱酸强碱条件下适应力及对RAW264.7细胞的黏附、侵袭和胞内增殖有关。本研究为LIPI-4的功能研究奠定了基础。

血清CXCL5、sICAM-1与非肌层浸润性膀胱癌患者术后转归的相关性

目的探析血清趋化因子配体5(CXCL5)、可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)与非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)患者术后转归的关系。方法采用便利抽样法,选取118例接受手术治疗的NMIBC患者,术后对患者进行为期1年的随访,观察患者无瘤生存期。比较不同CXCL5、sICAM-1水平的患者临床病理特征和无瘤生存期情况;采用COX回归验证血清CXCL5、sICAM-1水平与患者术后无瘤生存期的关系;采用Kaplan-Meier生存分析检验不同CXCL5、sICAM-1水平患者的无瘤生存期。结果经双变量Pearson相关系数检验,NMIBC患者血清CXCL5、sICAM-1水平之间呈正相关(γ=0.328,P<0.001)。血清CXCL5、sICAM-1高表达组中NMP22≥10 U/ml、低分化患者占比高于低表达组,差异有统计学意义(P<0.05);但血清CXCL5、sICAM-1不同表达组的年龄、性别、TNM分期、病灶大小及病灶数量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。118例NMIBC患者中,经为期1年的随访,有34例出现复发,复发率为28.81%;经单因素和多因素COX回归分析结果显示,血清CXCL5、sICAM-1水平与NMIBC患者无瘤生存情况有关(P<0.05);血清CXCL5、sICAM-1水平高表达组的总体无瘤生存时间均低于低表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论血清CXCL5、sICAM-1水平与NMIBC患者术后转归具有一定的相关性。

牛种布鲁氏菌A19 VirB启动子缺失株的构建及其生物学特性研究

为探究VirB基因对牛种布鲁氏菌A19株毒力的影响,深入了解布鲁氏菌胞内存活的机制,本研究以牛种布鲁氏菌A19株为模板,利用VirB基因的上下游同源臂融合kana抗性基因构建自杀质粒。以瞬间电击的方式,将自杀质粒电转进菌体,利用同源重组将VirB启动子用kana基因替换,构建A19ΔVirB缺失株。通过实时荧光定量PCR检测缺失株VirB相关蛋白的转录水平,并对缺失株的生长曲线、体外应激、黏附侵袭及胞内生存进行分析。结果显示,试验成功构建A19ΔVirB缺失株。实时荧光定量PCR结果显示,缺失株VirB相关蛋白的表达量极显著低于A19株(P<0.01),其生长曲线虽然不同于亲本株,但生长趋势相同。体外应激结果显示,A19株和A19ΔVirB株热休克应激没有明显变化,但在强酸、强碱、高盐的刺激下,A19株的存活率显著高于A19ΔVirB株(P<0.05)。黏附侵袭结果显示,缺失株对巨噬细胞的黏附侵袭能力近似于亲本株。胞内生存结果显示,随着时间的延长,A19株的胞内存活趋势逐渐上升,而缺失株A19ΔVirB总体趋势逐渐下降并且与A19的差距越来越大。综上所述,本研究成功构建了VirB启动子缺失株,极显著降低了相关蛋白的表达,为后续相关缺失株的构建及布鲁氏菌毒力的研究奠定基础。

鼠李糖乳杆菌抑制阪崎克罗诺杆菌致脑膜炎的体内外实验

目的考察鼠李糖乳杆菌(LGG)对阪崎克罗诺杆菌致脑膜炎的抑制作用。方法以Caco-2细胞为体外模型,采用黏附侵袭实验研究阪崎克罗诺杆菌对Caco-2细胞的黏附侵袭作用及最佳感染时间,并用不同浓度的LGG与Caco-2细胞作用,确定其抑制阪崎克罗诺杆菌的最佳浓度。进一步通过竞争、排斥和置换实验检测LGG对阪崎克罗诺杆菌黏附侵袭的抑制作用。通过体内实验,研究LGG对乳鼠脑膜炎的作用效果。结果阪崎克罗诺杆菌对Caco-2细胞具有黏附侵袭性,最佳感染时间为3 h。随着加入LGG浓度的增加,阪崎克罗诺杆菌对Caco-2细胞的黏附和侵袭作用被显著抑制。LGG能通过竞争、排斥作用抑制阪崎克罗诺杆菌对Caco-2细胞的黏附。LGG对阪崎克罗诺杆菌引起的脑膜炎具有预防和治疗作用,且预防效果更显著。结论通过体内外实验,LGG可以抑制阪崎克罗诺杆菌进入肠屏障,从而减少其穿越血脑屏障的量,最终达到预防和治疗脑膜炎的效果。

四种牙周致病菌侵入血管内皮细胞能力的体外研究

目的研究和比较4种常见牙周致病菌Pg33277、Pi25611、Aa29522和Fn10953黏附和侵入人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的能力，为深入探讨牙周致病菌感染HUVEC在促进动脉粥样硬化发生、发展中的作用奠定初步基础。方法建立牙周致病菌感染HUVEC的体外模型，采用扫描电镜、抗生素保护一菌落计数法观察以上牙周致病菌黏附和侵入HUVEC的能力。结果扫描电镜结果表明P酚3277、Pi25611、Aa29522和Fnl0953均可黏附于HUVEC；抗生素保护法结果发现Pg33277、Pi25611、Aa29522和Fn10953均可侵入HUVEC，细菌侵入量分别为（0．8±0．1）×10^8、（4．1±0．5）×10^6、（1．6±0．3）×10^6、（5．0±0．4）×10^6CFU／L，侵入率分别为（0．400±0．050）％、（0．021±0．003）％、（0．008±0．002）％和（0．025±0．002）％，Pg33277侵入能力远较其他3种牙周致病菌强（P〈0．001），其余3种牙周致病菌问的侵入能力差异无统计学意义（P〉0．05）。结论4种常见牙周致病菌Pg33277、Pi5611、Aa29522和Fn10953均可黏附和侵入HUVEC，pg33277侵入能力最强，这可能为其进一步发挥相关的生物学作用奠定基础。

鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株的构建及其相关功能研究

目的构建鼻疽诺卡菌IFM10152哺乳动物侵袭基因4A(mammalian cell entry 4A,mce4A)缺失株,并分析该基因在鼻疽诺卡菌感染宿主细胞中发挥的作用。方法采用无抗生素标记的框内缺失法构建鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株,通过PCR及测序的方法进行验证。进行体外生长实验、用THP-1(人白血病单核细胞系)作为体外模型进行巨噬细胞杀菌试验以及用HeLa(宫颈癌上皮细胞系)细胞进行体外黏附侵袭试验来分析mce4A基因在鼻疽诺卡菌与宿主细胞相互作用中发挥的功能。结果成功构建无抗生素标记的mce4A基因框内缺失株,命名为△mce4A;缺失株与野生株生长速度无明显差异。通过实验证明,mce4A基因敲除后,鼻疽诺卡菌抵抗巨噬细胞杀伤能力明显减弱,且鼻疽诺卡菌的黏附侵袭能力也明显减低。结论成功构建了鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株,mce4A基因在鼻疽诺卡菌黏附侵袭宿主细胞及巨噬细胞内存活过程中可能发挥了重要作用。

鼠伤寒沙门菌CVCC541 rhs基因内部元件缺失株的构建及其功能

利用Red同源重组系统构建5株rhs内部元件缺失株以及回补株,并通过HeLa细胞黏附和侵袭试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬后存活试验、小鼠致病力试验鉴定rhs内部元件缺失后对菌株黏附能力、侵袭能力和小鼠致病力的影响。旨在通过敲除鼠伤寒沙门菌CVCC541的2个rhs基因的内部元件rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core和rhs-2C构建相应缺失株及回补株,研究其对该菌侵袭宿主细胞能力的影响。结果表明,鼠伤寒沙门菌rhs基因内部元件的缺失均增强了其黏附侵袭和抗吞噬能力,但极显著降低了该菌的致病力。回补株对生长速率没有影响,其黏附侵袭能力与亲本株相比没有显著差异,抗吞噬能力与亲本株相比均有显著差异,对小鼠致病力与亲本株相比显著降低。

猪链球菌2型98HAH33基因0955的功能研究

目的对猪链球菌2型98HAH33基因0955进行功能研究。方法比较野生株、突变株和回复株在不同时期的生长情况,细菌黏附和血中存活比较它们对宿主黏附和抗吞噬能力的差异,小鼠和仔猪模型比较它们在毒力方面的差异。结果突变株和回复株在对数生长期生长略慢于野生株,但在平台期生长情况一致;细菌黏附证明基因0955可能是猪链球菌2型98HAH33的一个新黏附因子;血中存活证明基因0955和抗吞噬无关;小鼠和仔猪实验证明基因0955可能是猪链球菌2型98HAH33的一个新毒力因子。结论猪链球菌2型98HAH33基因0955可能是新鉴定的黏附因子和毒力因子。