基于性信息诱捕监测广东桔小实蝇和瓜实蝇发生动态及其对2种常用农药的抗药性评价

利用性信息素诱捕的方法对广东省茂名、佛山、梅州和韶关的桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)和瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)种群动态进行监测;并用药膜法测定了两种实蝇不同地理种群成虫对阿维菌素和甲维盐的抗药性情况。结果表明,桔小实蝇和瓜实蝇在所监测的4个地市全年均有发生,桔小实蝇和瓜实蝇种群数量发生高峰期集中在5月中旬至8月中旬,从4月中旬开始田间种群数量开始增加,10月中旬以后种群数量急剧下降,高峰期与果实成熟期基本吻合。抗药性监测结果表明,桔小实蝇和瓜实蝇对阿维菌素和甲维盐的抗药性有逐年上升趋势,广东4个地市桔小实蝇和瓜实蝇已对阿维菌素产生中等抗性水平;2019年11月监测梅州地区桔小实蝇种群和韶关瓜实蝇种群对甲维盐抗性倍数分别为4.32和3.42倍,仍处于敏感水平,其余地区种群对甲维盐均达到了低水平或中等水平抗性。

阿维菌素对瓜实蝇3种解毒酶系的影响

【目的】探讨阿维菌素对瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae(Coquillett)]解毒酶系的影响,明确瓜实蝇阿维菌素抗性与解毒酶的关系,为瓜实蝇抗药性综合治理和科学用药提供理论基础。【方法】采用饲毒法测定阿维菌素对瓜实蝇成虫敏感品系(SS)和抗阿维菌素品系(RS)的亚致死浓度(LC_(25))及致死中浓度(LC_(50));利用微孔板法测定SS品系和RS品系经阿维菌素LC_(25)、LC_(50)剂量处理12、24、48和72 h后其体内谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GSTs)、羧酸酯酶(Carboxylesterase,CarE)活性,采用ELISA试剂盒法测定细胞色素P450单加氧化酶(Cytochrome P450 monooxygenases,P450s)含量;测定比较SS品系和RS品系GSTs、CarE米氏常数(K_(m))及最大反应速率(V_(max))的变化及增效剂顺丁烯二酸二乙酯(DEM)、磷酸三苯酯(TPP)和增效醚(PBO)对阿维菌素的增效作用。【结果】与SS品系相比,RS品系体内GSTs和CarE活性均显著上升(P<0.05,下同),分别为SS品系的2.92和1.46倍,P450s含量则显著下降,为SS品系的68.0%。SS品系在LC_(25)剂量的阿维菌素处理后12、48 h及LC_(50)处理后12、24、48 h和RS品系在LC_(25)剂量处理后12 h、LC_(50)处理后72 h,其体内GSTs活性均被诱导显著增强;LC_(25)剂量处理后24 h,SS品系体内CarE活性被诱导显著增强,RS品系中LC_(25)处理后72 h和LC_(50)处理后各时间段CarE活性表现为被显著抑制;LC_(50)处理后12 h,P450s含量在SS品系中表现为显著降低,而在72 h则显著升高。与SS品系相比,RS品系GSTs的K_(m)显著降低,V_(max)显著升高,CarE的K_(m)和V_(max)变化不明显;增效剂DEM、TPP和PBO在SS品系中的增效比分别为1.03、1.04和2.08,在RS品系中的增效比分别为3.45、2.52和2.26,相对增效系数分别为0.71、0.60和0.54。【结论】GSTs和CarE解毒酶参与了瓜实蝇对阿维菌素的抗性形成,其中GSTs活性发生了量变和质变,其对底物亲和力增加和代谢速度增快,在瓜实蝇对阿维菌素抗性形成中起到主导作用。

瓜实蝇不同发育期及组织实时荧光定量PCR内参基因筛选

【目的】筛选出适用于瓜实蝇[Zeugodacus cucurbitae(Coquillett)]抗药性分子机制及生理分子机制研究的内参基因及最优组合数,为瓜实蝇抗药性机理研究打下基础。【方法】以不同发育期的敏感品系和抗阿维菌素品系瓜实蝇及其不同组织样本为试验材料,将8个候选内参基因通过实时荧光定量PCR进行表达检测,并利用geNorm、NormFinder、Bestkeeper和RefFinder软件对内参基因表达稳定性进行综合评估分析,筛选出最稳定表达的内参基因并明确最优组合数。【结果】geNorm分析结果显示,不同发育期处理内参基因表达稳定性排序为RPS13=RpL32(0.269)>TUBE(0.623)>TBP(0.702)>β-tubulin(1.069)>G6PDH(1.366)>Actin3(1.596)>Actin2(1.923);不同组织处理内参基因表达稳定性排序为RpL32=RPS13(0.132)>TBP(0.345)>TUBE(0.442)>β-tubulin(0.552)>G6PDH(0.780)>Actin2(1.101)>Actin3(1.417),最适内参基因个数为2。NormFinder分析结果显示,不同发育期处理内参基因表达稳定性排序为RpL32(0.399)>RPS13(0.446)>TUBE(0.738)>G6PDH(0.912)>TBP(0.924)>β-tubulin(1.086)>Actin3(1.092)>Actin2(1.866);不同组织处理内参基因表达稳定性排序为RpL32(0.090)>RPS13(0.117)>TBP(0.389)>TUBE(0.445)>β-tubulin(0.705)>G6PDH(0.877)>Actin2(1.009)>Actin3(1.567)。BestKeeper分析结果显示,不同发育期处理内参基因表达稳定性排序为TUBE>TBP>RPS13>RpL32>β-tubulin>G6PDH>Actin3>Actin2;不同组织处理内参基因表达稳定性排序为β-tubulin>TBP>TUBE>RPS13>RpL32>G6PDH>Actin2>Actin3。RefFinder分析结果显示,不同发育期处理内参基因表达稳定性排序为RpL32>RPS13>TUBE>TBP>G6PDH>β-tubulin>Actin3>Actin2;不同组织处理内参基因表达稳定性排序为RPS13>RpL32>TBP>β-tubulin>TUBE>G6PDH>Actin2>Actin3。【结论】RPS13和RpL32可组合作为瓜实蝇不同发育期、不同组织及阿维菌素抗性分子机制和生理分子机制研究的内参基因。

温度对瓜实蝇实验种群生长发育及生殖的影响研究

【目的】研究温度对广西瓜实蝇生长发育的影响,为瓜实蝇的综合防治提供理论依据。【方法】采用人工恒温饲养方法,分别设置15、20、25、30、35℃5个恒温条件,测定不同恒温条件下瓜实蝇的生长发育、存活和繁殖情况。【结果】瓜实蝇卵、幼虫、蛹、产卵前期和世代的发育起点温度分别为10.56、7.33、10.77、9.72和10.77℃,有效积温分别为12.68、117.91、107.15、364.43和602.17℃·d;在35℃时蛹不能存活,25℃时单雌产卵量最大,平均每头雌虫产卵1428.30粒,15℃时最低,平均240.30粒;在15～30℃时,瓜实蝇实验种群趋势指数均大于1,在25、30℃时,种群趋势指数最大,分别为447.37和301.19。【结论】15～30℃范围内瓜实蝇可正常发育,25～30℃为其最适生长发育及繁殖温度。

瓜实蝇对寄主植物的产卵选择性

瓜实蝇Bactroceracu curbitae(Coquillett)可危害100多种寄主植物,是葫芦科蔬菜的重要害虫。为了探明瓜实蝇的寄主特异性,在实验室条件下研究了瓜实蝇对黄瓜Cucumis sativus、苦瓜Momordica charantiap、丝瓜Luffa cylindrica、南瓜Cucurbita moschata、番木瓜Carica papaya和西葫芦Cucurbita pepo的产卵选择性。瓜实蝇在苦瓜和黄瓜上的产卵比率较高,分别为56.18%和29.00%,在番木瓜和南瓜上产卵比率较低,分别为1.85%和0.00%,但是在去掉果皮后,黄瓜、西葫芦和南瓜的产卵比率较高,分别达到34.64%、30.37%和18.05%,在番木瓜上的产卵率较低仅为0.60%。瓜实蝇雌虫在带皮果实上的产卵比率与果皮硬度呈显著的负相关关系,相关系数为-0.8772。结果表明除了自身的化合物之外,植物具有的物理屏障如坚硬的表皮会影响瓜实蝇产卵。

球孢白僵菌对瓜实蝇的毒力研究

应用球孢白僵菌‘MZ041016’菌株对瓜实蝇幼虫、蛹和幼虫进行毒力测定。结果表明:幼虫、蛹和成虫的最高死亡率分别为(92.68±4.55)%、(82.97±2.75)%和(94.16±1.52)%;幼虫、蛹和成虫的致死中浓度(LC50)分别为(2.178±0.375)×105、(2.884±0.527)×105和(2.269±0.352)×105个/mL;致死中时间(LT50)分别为(4.238±0.259)、(4.518±0.365)和(3.853±0.263)d。

瓜实蝇热激蛋白基因hsp70的克隆及序列分析

【目的】克隆分析瓜实蝇热激蛋白hsp70基因序列特征,为进一步研究瓜实蝇的热适应性机制及制定综合防治策略奠定基础。【方法】根据NCBI数据库中已报道的昆虫hsp70基因保守序列,设计合成扩增瓜实蝇hsp70基因部分片段的简并引物,并利用RACE-PCR扩增其全长序列。【结果】克隆获得瓜实蝇hsp70基因c DNA全长序列(获取号:KM112021)2271 bp,含1911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸,具有真核生物hsp70基因家族的3个明显基序标签,同时在C-末端具有EEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白。BLAST分析结果表明该序列与双翅目实蝇科昆虫hsp70基因高度相似,最高相似度达91%。氨基酸序列系统发育分析结果显示,瓜实蝇与双翅目实蝇科昆虫聚类为一个分支,证实hsp70基因的高度保守。【结论】瓜实蝇hsp70基因具有真核生物hsp70基因家族的特征,序列表现为高度的保守性,可作为今后研究瓜实蝇抗逆性机制的一个参数指标。

瓜实蝇普通气味结合蛋白基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP。测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨基酸。氨基酸序列比对及三维结构同源建模表明,此序列具有OBPs的典型特征,序列中具有6个保守的半胱氨酸和6个α螺旋区域。构建了重组表达载体pET28a(+)-BcucOBP,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在IPTG进行诱导下目标蛋白以His-标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR分析表明,BcucOBPmRNA在除雌虫腹节外的各个组织中都有表达,但在触角中的表达量最高。另外,BcucOBPmRNA在昆虫前足和生殖节中具有明显的性别差异表达特征,推测其不仅具有普通气味蛋白的功能,还可能参与了信息素的运输过程,在瓜实蝇交配行为中发挥重要作用。

三亚瓜类作物上实蝇优势种类鉴别及不同诱捕处理的效果

实蝇是园艺作物上的重大害虫,长期使用化学防治已产生抗药性,为减缓实蝇的抗药性产生速度而开展了实蝇类害虫绿色防控技术研究。通过对甜瓜及苦瓜上的实蝇种类进行调查,并比较了4种不同诱捕方法对瓜实蝇、橘小实蝇的诱捕效果。结果表明,甜瓜大棚内的实蝇优势种群为瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae Coqillett),露地苦瓜的实蝇优势种群为橘小实蝇(Bactrocera dorsalis Hende);4种不同诱捕处理对瓜实蝇、橘小实蝇的诱捕效果差异显著,其中黄色粘虫板+瓜果实蝇诱粘剂的诱捕处理诱捕的瓜实蝇、橘小实蝇数量最多,诱捕效果最好,建议生产上可结合使用悬挂黄色粘虫板+瓜果实蝇诱粘剂的诱捕方法防治瓜实蝇、橘小实蝇。

几种杀虫剂及其混配对瓜实蝇成虫的毒力测定

采用微量点滴法,测定了毒死蜱、甲维盐、敌敌畏、顺式氯氰菊酯等4种杀虫剂对瓜实蝇成虫的毒力和二元混配的联合毒力。结果表明:80%敌敌畏乳油(EC)的LD50最小,为1.6839μg.g-1;100g.L-1顺式氯氰菊酯EC的LD50最大,为8.8770μg.g-1。供试杀虫剂毒性大小依次为:80%敌敌畏EC>5%甲维盐微乳剂(ME)>480g.L-1毒死蜱EC>100g.L-1顺式氯氰菊酯EC。敌敌畏与甲维盐(1:1)混配的增效作用最强,共毒系数为426。

瓜实蝇过冷却点的测定

采用热敏电阻法对瓜实蝇1日龄幼虫、5日龄幼虫、1日龄蛹、3日龄蛹、5日龄蛹、1日龄雌成虫、1日龄雄成虫、5日龄雌成虫、5日龄雄成虫进行过冷却点和结冰点的测定。结果表明:各虫态以5日龄蛹的过冷却点和3日龄蛹的结冰点最低,分别为(-16.72±0.23)℃和(-13.14±0.55)℃;以5日龄幼虫的过冷却点和结冰点最高,分别为(-14.32±0.45)℃和(-5.52±0.47)℃;各虫态的过冷却点由低到高的顺序为:5日龄蛹<3日龄蛹<5日龄雄成虫<1日龄雄成虫<1日龄蛹<5日龄雌成虫<1日龄幼虫<1日龄雌成虫<5日龄幼虫。

三种常见实蝇的形态学、生物学和生态学比较

对瓜实蝇Bactrocera(Tetradacus) minax(Enderlein)、桔小实蝇Bactrocera(Bactrocera)dorsalis(Hendel)和桔大实蝇Bactrocera(Zeugodacus)cucurbitae(Coquillett)形态学、生物学、生态学等方面进行了比较和分析,包括三种实蝇在国内外的分布情况,对寄主选择的差异,各种虫态的形态特征,发育历期和生活史,并对它们的危害状况和防治方法分别作了介绍,可为3种实蝇的鉴定和防治提供参考。

瓜实蝇卵巢的发育阶段及分级

瓜实蝇是热带和亚热带地区最重要的经济害虫之一。本研究拟对卵巢发育进行分级，以判断田间捕获的瓜实蝇是否达到性成熟。室内饲养瓜实蝇成虫，对开始羽化至羽化后80 d的不同日龄成虫卵巢进行解剖，并记录了卵巢长度、卵巢宽度、卵巢指数（卵巢长度＆#215;卵巢宽度）和所含卵粒数。将瓜实蝇卵巢发育过程分为4期6个级别，分别为卵黄发生前期（Ⅰ级和Ⅱ级）、卵黄发生期（Ⅲ级和Ⅳ级）、抱卵期（Ⅴ级）、经产期（Ⅵ级）。随着卵巢的发育，Ⅰ～Ⅴ级卵巢长度和宽度迅速增长，卵巢发育成熟开始产卵以后，Ⅵ级卵巢长度和宽度逐渐减小。Ⅰ级和Ⅱ级卵巢长度与宽度大致相等，以后各期卵巢长度均大于宽度。Ⅲ级和Ⅳ级可见清晰的卵室，卵母细胞迅速增长，卵黄逐渐沉积。Ⅴ级可见清晰的卵粒，整个卵巢呈圆柱状。Ⅵ级开始排出卵子，所含卵粒数显著少于Ⅴ级；虽然此级卵巢长度大于Ⅳ级，但卵巢宽度、卵巢指数与Ⅳ级基本一致；Ⅵ级卵巢可见黄体，可结合黄体判定卵巢所处发育级别。本研究对评估粘虫板捕获的瓜实蝇雌虫生理日龄结构有潜在应用价值。

瓜实蝇DNA甲基化的MSAP体系建立与优化

瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae(Coquillett)]是中国重要的蔬菜害虫,但其DNA甲基化研究尚未见报道。甲基化敏感扩增多态性是研究DNA甲基化的重要技术之一。通过对酶切反应、连接、PCR扩增和引物筛选等条件优化,建立瓜实蝇MSAP反应体系,即:120μL酶切体系中加入10 U的限制性内切酶与600 ng基因组DNA,于37℃酶切反应过夜;220μL连接体系中加入T4连接酶1 U,HpaⅡ-MspⅠ-adapter接头50 pmol,Eco R I-adapter接头5 pmol,并于16℃反应12 h;3连接产物稀释后进行PCR预扩增和选择性扩增,再经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测结果。通过该体系筛选出适用于瓜实蝇基因组DNA甲基化多态性研究的6对引物;瓜实蝇MSAP体系为瓜实蝇的表观遗传学研究提供了技术支持。

苦瓜瓜实蝇的生物学特性及毒力测定

将将海南苦瓜生产中的重要入侵害虫瓜实蝇Bactroeera（Zeugodacus）cucurbitae（Coquillett）带回室内人工饲养，针对人工饲料、饲养方法及生长发育规律进行探索，发现在气温高达28-30℃时瓜实蝇各发育历期均有缩短．成虫最喜欢取食煮熟的南瓜、喜欢在整条的新鲜青瓜上产卵，幼虫饲养最佳选择也是新鲜青瓜。药剂毒力测定时药膜法比浸虫法操作简单且结果更为稳定，测定结果表明，供试药剂的最佳选择是阿维菌素，其次是甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、溴虫腈及啶虫脒。

瓜实蝇幼虫人工饲料设计及其优化

采用正交试验设计,对瓜实蝇幼虫人工饲料四种主要组成成分南瓜∶玉米粉=1∶1、酵母粉、蔗糖、苯甲酸钠进行优化筛选,以瓜实蝇幼虫的存活率、幼虫历期、老熟幼虫化蛹率、平均蛹重和羽化率作为试验考察指标,筛选出上述4种成分在瓜实蝇幼虫基础人工饲料中的最优量为南瓜∶玉米粉=200 g∶200 g、酵母60 g、蔗糖15 g、苯甲酸钠1.2 g。

瓜实蝇雄虫引诱剂配方的筛选

人工合成的化合物——覆盆子酮乙酸酯[4-(p-acetoxyphenyl)-2-butanone]是目前监测和防治瓜实蝇应用最广泛的雄性引诱剂。为改善引诱剂的诱捕效果,对覆盆子酮乙酸酯和与其结构相似的化合物覆盆子酮、对甲氧基苯丙酮以及几种酯类按照一定比例混配,利用旋转嗅觉仪进行室内试验,筛选出效果较好的5种配方在室外进行田间试验。结果表明,效果最好的配方为覆盆子酮乙酸酯∶对甲氧基苯丙酮∶乙酸丁酯=3∶1∶1。

2种瓜实蝇寄生蜂的研究进展

瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae Coquillett)是危害多种蔬菜和水果的重要害虫,化学防治效果成效甚微,生物防治有望成为最有潜力的防治技术。本文主要对瓜实蝇的寄生性天敌阿里山潜蝇茧蜂(Fopius arisanus Sonan)和弗氏短背茧蜂(Psyttalia fletcheri Silvestri)的生物学特性、影响寄生蜂存活和雌雄性比的主要因素、寄主范围及寄主选择性、扩繁技术及其对实蝇的防治效果等方面进行综述,为2种蜂在瓜实蝇生物防治中的应用提供参考。

应用SS-PCR技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇

[目的]为了促进果蔬进出口贸易和快速通关,防止瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae(Coquillett)]进一步传入扩散,迫切需要开展适合实蝇快速鉴定技术的研究。[方法]应用SS-PCR技术,基于mtDNA COⅠ序列,设计了1对能够准确鉴定瓜实蝇的种特异性引物GF85和GR531。选用瓜实蝇作为阳性对照,南瓜实蝇[B.tau(Walker)]、具条实蝇[B.scutellata(Hendel)]等其他19种待测实蝇作为阴性对照,提取供试虫样基因组DNA,并进行PCR扩增和电泳检测。[结果]仅虫样瓜实蝇能在约447 bp位置扩增出一条清晰且单一的条带,其余的虫样未出现条带。[结论]将该试验建立的SS-PCR鉴定方法应用于实际进出境果蔬截获和疫情监测的虫样的鉴定,并得到验证,表明该方法具特异性、稳定性强,可在实际的实蝇鉴定工作中应用。

瓜实蝇对不同寄主果实和不同颜色的趋向性研究

研究瓜实蝇对不同寄主果实和不同颜色的趋向性,结果表明瓜实蝇性成熟和性未成熟的雌、雄虫对苦瓜的趋向性最强,其次是黄瓜,对南瓜、丝瓜、番茄的趋向性较弱。瓜实蝇对黄色的趋向性最强,其次是绿色,对黑色的趋向性最差。