目的:构建小鼠Parkin co-regulated gene(Pacrg)/GFP-p Fast Bac1重组杆状病毒载体,并在Sf9昆虫细胞中表达。方法:PCR扩增小鼠全长Pacrg编码c DNA序列,通过TA克隆、连接等方法将该基因插入到携带e GFP的供体质粒p Fast Bac1中,获得重组...目的:构建小鼠Parkin co-regulated gene(Pacrg)/GFP-p Fast Bac1重组杆状病毒载体,并在Sf9昆虫细胞中表达。方法:PCR扩增小鼠全长Pacrg编码c DNA序列,通过TA克隆、连接等方法将该基因插入到携带e GFP的供体质粒p Fast Bac1中,获得重组载体rp FBac-Pacrg-GFP,然后转化到DH10Bac宿主菌中。筛选获得的重组杆状病毒载体r Bacmid-Pacrg-e GFP经脂质体转染至Sf9昆虫细胞中,荧光显微镜及Western印迹检测分析重组蛋白。结果:经测序及酶切鉴定显示构建的Pacrg/GFP-p Fast Bac1重组杆状病毒载体正确,Western印迹结果显示PACRG/e GFP融合蛋白在Sf9昆虫细胞中表达且携带绿色荧光。结论:成功构建了Pacrg/GFP-p Fast Bac1重组杆状病毒载体,且该重组蛋白在Sf9昆虫细胞中大量表达,为进一步研究PACRG蛋白的结构及其在精子发生中的调控作用奠定了基础。展开更多
文摘目的:构建小鼠Parkin co-regulated gene(Pacrg)/GFP-p Fast Bac1重组杆状病毒载体,并在Sf9昆虫细胞中表达。方法:PCR扩增小鼠全长Pacrg编码c DNA序列,通过TA克隆、连接等方法将该基因插入到携带e GFP的供体质粒p Fast Bac1中,获得重组载体rp FBac-Pacrg-GFP,然后转化到DH10Bac宿主菌中。筛选获得的重组杆状病毒载体r Bacmid-Pacrg-e GFP经脂质体转染至Sf9昆虫细胞中,荧光显微镜及Western印迹检测分析重组蛋白。结果:经测序及酶切鉴定显示构建的Pacrg/GFP-p Fast Bac1重组杆状病毒载体正确,Western印迹结果显示PACRG/e GFP融合蛋白在Sf9昆虫细胞中表达且携带绿色荧光。结论:成功构建了Pacrg/GFP-p Fast Bac1重组杆状病毒载体,且该重组蛋白在Sf9昆虫细胞中大量表达,为进一步研究PACRG蛋白的结构及其在精子发生中的调控作用奠定了基础。
