High glucose causes apoptosis of rabbit corneal epithelial cells involving activation of PERK-eIF2α-CHOP-caspase-12 signaling pathway

AIM: To investigate the effect of high concentration of glucose(HCG) on double stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase(PERK)-eukaryotic initiation factor-2α(eIF2α)-transcription factor C/EBP homologous protein(CHOP)-cysteine aspartate specific proteinase(caspase-12) signaling pathway activation and apoptosis in rabbit corneal epithelial cells(RCECs). METHODS: RCECs were treated by different concentrations of glucose for 0-48 h. The expressions of PERK, p-PERK, eIF2α, p-eIF2α, 78 k Da glucose-regulated protein 78(GRP78), CHOP, B-cell lymphoma 2(Bcl-2), B-cell lymphoma-2-associated X protein(Bax) and caspase-12 were determined by Western blot. Apoptosis was detected by TUNEL assay. Meanwhile, the function of PERK-eI F2α-CHOP-caspase-12 signaling pathway activation in high glucose-induced apoptosis was evaluated using PERK inhibitor, GSK2606414. RESULTS: HCG significantly promoted the expression of p-PERK, p-eIF2α, GRP78, CHOP, Bax and cleaved caspase-12 in RCECs(P<0.05), while remarkably decreased the expression of Bcl-2 and caspase-12(P<0.05), and the alterations caused by glucose were in concentration-and time-dependent manners. Meanwhile, PERK and eIF2α expressions were not affected in all groups(P>0.05). TUNEL assay showed that the apoptosis rate of RCECs in the HCG group increased significantly in contrast with that in the normal concentration of glucose or osmotic pressure control group(P<0.05), and the apoptosis rate increased with the increase of glucose concentration within limits(P<0.05). GSK2606414 down-regulated the expression of p-PERK and p-eI F2α in the HCG group(P<0.05), while still did not affect the expression of PERK and eIF2α among groups(P>0.05). Correspondingly, GSK2606414 also significantly reduced the apoptosis rate induced by high glucose(P<0.05). CONCLUSION: HCG activates PERK-eIF2α-CHOPcaspase-12 signaling pathway and promotes apoptosis of RCECs.

Effects of different concentrations of tetramethylpyrazine,an active constituent of Chinese herb, on human corneal epithelial cell damaged by hydrogen peroxide

AIM: To discuss the effects of different concentrations of tetramethylpyrazine(TMP), an active constituent of Chinese herb, on damaged Shandong human corneal epithelial cell(SDHCEC) induced by hydrogen peroxide.METHODS: We detected the combined effects of TMP with concentrations ranging from 4 mg/m L to 0.03 mg/m L and 800 μM hydrogen peroxide on SDHCEC. The methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay was processed at 3, 6and 12 h separately while the detection of cell apoptosis at 6h only by flow cytometry.RESULTS: The viability of SDHCEC with 0.5 mg/m L,0.25 mg/m L, 0.125 mg/m L and 0.06 mg/m L TMP joint with800 μM hydrogen peroxide at 3h and 6h was significantly higher than that with 800 μM hydrogen peroxide only, P 【0.05. However, except 0.25 mg/m L, TMP with other concentrations joint with 800 μM hydrogen peroxide at12 h could not significantly inhibit decreased SDHCEC viability induced by 800 μM hydrogen peroxide. At 12 h,TMP of 0.5 mg/m L, 0.25 mg/m L, 0.125 mg/m L and 0.06 mg/m L could significantly inhibit SDHCEC early apoptosis induced by 800 μM hydrogen peroxide, most remarkable at 0.25 mg/m L TMP, P 【0.05.CONCLUSION: Our results suggested that hydrogen peroxide can induce apoptosis related damage to SDHCEC. TMP can protect SDHCEC from the damage,and the protective effects may be associated with its anti-apoptosis mechanism.

Bad在正常人角膜上皮细胞中表达的免疫组化研究

目的 探讨正常人角膜上皮中Bad蛋白的表达状况。方法 用免疫组化的方法(SP)观察8例Bad在正常成人角膜组织中的表达状态。结果 正常人角膜上皮表层细胞、角膜上皮基底细胞,包括角膜缘基底细胞中均有Bad表达,中央及周边部角膜上皮表层细胞Bad表达量无明显区别,角膜上皮表层和基底细胞间的绝大多数有丝分裂后仅部分细胞有Bad表达。结论Bad参与了正常角膜上皮细胞的自我更新过程,可能具有促进角膜上皮细胞凋亡的作用。如能抑制Bad基因的表达可能会在一定程度上延缓角膜上皮的脱落,加速角膜上皮损伤后的修复及维持正常角膜上皮的完整与稳定。

表皮生长因子受体、血管内皮生长因子受体和BAD在非小细胞肺癌中的表达

背景与目的:表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)均属酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,RTK),可调控细胞的增殖、分化与生存。BAD是Bcl-2家族中的促凋亡信号成分,在调控细胞凋亡特别是肿瘤细胞凋亡过程中发挥重要作用。但目前人们对上述这些重要蛋白在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中的表达与肿瘤病理学的关系所知甚少。本研究探讨ECFR、VEGFR、BAD和磷酸化BAD在NSCLC中的表达情况以及与肿瘤病理的关系。方法:使用组织微阵列(tissue microarray,TMA)切片的免疫组织化学法,NSCLC患者51例(26例腺癌,16例鳞癌,8例大细胞癌,1例大细胞神经内分泌癌)。结果:51例患者中EGFR和VEGFR分别在10例(20%)和14例(27%)中出现过度表达。大细胞癌中未见VEGFR表达(0/8例),而鳞癌和腺癌患者中VEGFR表达分别为44%(7/16)和27%(7/26)。EGFR和VEGFR的表达与性别,肿瘤细胞分化及肿瘤浸润程度(包括胸膜浸润,血管浸润,淋巴结转移,肺内播散,脑转移情况)无关。51例患者中22例(43%)出现BAD蛋白表达缺失,且NSCLC的不同病理类型间差异有显著性。BAD蛋白表达缺失在16例鳞癌患者中10例(63%),8例大细胞癌患者中5例(63%),26例鳞癌患者中有7例(27%)(P=0.04)。51例患者中25例(49%)出现磷酸化BAD蛋白过度表达[其中26例腺癌患者中有13例(50%),16例鳞癌患者中有8例(50%),8例大细胞癌患者中有4例(50%)]。BAD蛋白的表达缺失与磷酸化BAD蛋白的过度表达经统计检验与上述肿瘤浸润程度无相关性。结论:肺鳞癌出现VEGFR表达增高的可能较大,而大细胞癌出现VEGFR表达增高的可能最小。在鳞癌和大细胞癌中可见BAD蛋白表达的显著缺失。NSCLC患者EGFR,VEGFR,磷酸化BAD蛋白的过度表达以及BAD蛋白表达的缺失与病理浸润程度无关。但这些受体酪氨酸激酶表达以及与NSCLC凋亡直接相关的媒介因子可能成为未来多靶向治疗中的候选靶标。

老年性及先天性白内障晶状体上皮细胞凋亡及相关基因的表达

目的探讨老年性及先天性白内障患者晶状体上皮细胞(LECs)凋亡及其相关基因表达的关系。方法采用原位末端标记及免疫组织化学的方法,对30例老年性白内障患者、15例先天性白内障患者及15例正常人LECs中的凋亡细胞及c-fos、c-jun等相关基因蛋白的表达进行检测。结果30例老年性白内障患者LECs凋亡率为15·10%±7·83%,正常对照组为0(P<0·01),先天性白内障组0·01%±0·028%(P>0·05)。老年性白内障组中c-fos及c-jun阳性表达的细胞率均明显高于对照组(P<0·01),与凋亡细胞率呈正相关(r=0·8660,0.4021);先天性白内障及正常组中均极少或未见相关基因的表达。结论LECs凋亡与老年性白内障密切相关,c-fos与c-jun蛋白的表达可能与LECs凋亡有关。

低浓度地塞米松对兔角膜上皮细胞的影响(英文)

目的: 探讨地塞米松(dexam ethasone,D EX)对培养的兔角膜上皮细胞和角膜上皮伤口愈合的影响。方法: 体外实验原代培养兔角膜上皮细胞, 用四唑盐(M TT)实验和流式细胞仪检测不同浓度 D EX 对兔角膜上皮细胞的作用, 同时通过 H E 、免疫组织化学染色和扫描电镜及临床观察兔角膜上皮细胞刮除后 0.1g/L D EX 用药组和对照组伤口愈合的情况。结果: M TT 检测显示小于 0.1g/L 浓度的 D EX 对兔角膜上皮细胞的生长无明显影响。流式细胞仪检测到 0.1g/L 浓度的 D EX 对兔角膜细胞生长周期无抑制作用。动物实验: 0.1g/L 地塞米松作用后上皮愈合时间显著性缩短, 两组中新生成的上皮细胞均有较强的 PC N A 蛋白的表达。0.1g/L 地塞米松组与对照组相比, 电子显微镜检查角膜基质排列更规则, 炎症反应较轻。结论: 低于 0.1g/L 浓度的地塞米松对培养的兔角膜上皮细胞的生长无抑制作用。0.1g/L 浓度的地塞米松眼液能有效的促进角膜上皮生长并降低炎症反应, 将有利于准分子激光角膜屈光手术后早期角膜伤口愈合。

爱普列特对原代培养大鼠输精管上皮细胞及bcl-2表达的影响

目的 探讨爱普列特对原代培养SD大鼠输精管上皮细胞及原癌基因bcl 2表达的影响。方法 应用HE染色、电镜、流式细胞术和免疫组化方法研究爱普列特对输精管上皮细胞形态改变、细胞凋亡率以及bcl 2表达的影响。结果 0 1 μmol·L- 1 爱普列特对细胞形态无显著影响 ;0 3和 1 0 μmol·L- 1 爱普列特作用 72h后 ,细胞呈核固缩、深染、碎裂、染色质边集等多种形态改变 ,电镜下可见典型的凋亡细胞特征 ;流式细胞仪分析结果显示 ,溶剂对照组细胞凋亡率为 3 42 %± 1 49% ,0 1、0 3和 1 0 μmol·L- 1 爱普列特作用 72h后 ,细胞凋亡率分别为 4 66 %± 2 2 3 % ,39 0 4 %± 1 0 69%和 52 74%± 8 91 % ;免疫组化结果显示输精管上皮细胞bcl 2阳性率为 76 96 %± 9 2 5 % ,0 1、0 3和 1 0 μmol·L- 1 爱普列特作用 72h后 ,Bcl 2阳性表达的百分率分别为 63 93 %± 3 40 %、52 82 %± 8 66 %和 2 9 64 %± 8 74%。结论 0 1 μmol·L- 1 爱普列特对大鼠输精管上皮细胞无影响 ,0 3和 1 0 μmol·L- 1 可诱导大鼠输精管上皮细胞发生凋亡 ,其作用机制可能与降低bcl

层粘连蛋白对体外角膜上皮细胞凋亡的保护

目的 观察层粘连蛋白 (LN)对离体角膜上皮细胞存亡的影响 ,以寻找预防角膜上皮细胞凋亡的途径。方法 应用流式细胞仪 (FACStarplus)检测凋亡细胞的亚 2倍体DNA的方法 ,对基础培养的、与LN共育的以及阻断LN受体后的兔角膜上皮细胞的凋亡情况进行了对比观察及分析。结果 基础培养的第 6代角膜上皮细胞出现明显的细胞凋亡 ;与LN共育的角膜上皮细胞凋亡不明显 ;阻断LN受体后 ,角膜上皮细胞出现显著的凋亡现象。结论 LN对离体培养的角膜上皮细胞的凋亡有保护作用。

BIGH3基因突变子R124C的过表达及其对人角膜上皮细胞的影响

目的对我国常见的BIGH3基因相关性人角膜营养不良的热点突变R124C进行体外定点诱变研究,并构建其真核表达载体,探讨其过表达对人角膜上皮细胞的影响。方法以pMD18-T/BIGH3载体为模板扩增野生型BIGH3基因全长编码序列,克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP上,采用快速体外定点诱变技术获得R124C突变体。瞬时转染体外培养的人角膜上皮细胞,免疫印迹检测野生与突变型BIGH3基因的表达,分别检测细胞培养基中TNF-α的含量,并收集细胞,分析caspase-3活性。结果 PCR成功扩增了野生型和R124C突变型的BIGH3基因,两种重组表达质粒转染人角膜上皮细胞后,免疫印迹检测结果证实其均在细胞中表达。细胞因子TNF-α分泌量增加,同时R124C型突变也可导致caspase-3酶活性增高。结论应用快速体外定点诱变技术,成功获得突变型R124C-BIGH3基因,转染人角膜上皮细胞后,通过caspase-3途径引起细胞凋亡,并上调分泌因子TNF-α。

β1整合素过表达抑制角膜上皮细胞凋亡的研究

目的探讨β1整合素功能性过表达对角膜上皮细胞凋亡的影响及机制,为角膜细胞移植提供理论依据。方法构建β1整合素-绿色荧光蛋白(GFP)融合基因并转染兔角膜上皮细胞。观察融合基因在角膜上皮细胞的表达及对各细胞外基质蛋白的黏附能力。检测β1整合素功能性转染对角膜上皮细胞凋亡及丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化的影响。结果β1整合素-GFP融合基因成功转染至兔角膜上皮细胞并过表达;β1整合素过表达能够明显增加角膜上皮细胞对各细胞外基质蛋白的黏附力并抑制角膜上皮细胞凋亡及促使MAPK磷酸化。结论β1整合素过表达能有效抑制角膜上皮细胞凋亡,MAPK磷酸化可能在这一过程中起重要作用。

冰片对兔角膜上皮细胞的损伤作用

【目的】观察冰片对兔角膜上皮细胞的损伤作用。【方法】以浓度分别为100、200、400μg/m L的冰片作用于兔角膜上皮细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性,Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率;Real-time PCR法检测细胞凋亡相关基因Caspase-3 m RNA的表达。【结果】不同浓度的冰片均可抑制兔角膜上皮细胞的活性;与正常对照组比较,冰片组可增加兔角膜上皮细胞的凋亡率,增强Caspase-3 m RNA的表达(P<0.05或P<0.01)。【结论】冰片能抑制兔角膜上皮细胞的生长,诱导细胞发生凋亡,其机制与增强凋亡相关基因Caspase-3m RNA的表达有关。

β1整合素过表达抑制角膜上皮细胞凋亡的实验研究(英文)

目的:探讨β1整合素功能性过表达对角膜上皮细胞凋亡的影响及机制,为角膜细胞移植提供理论依据。方法:构建β1整合素-绿色荧光蛋白(GFP)融合基因并转染兔角膜上皮细胞。观察融合基因在角膜上皮细胞的表达及对各细胞外基质蛋白的黏附能力。检测β1整合素功能性转染对角膜上皮细胞凋亡及丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAP激酶)磷酸化的影响。结果:β1整合素-GFP融合基因成功转染至兔角膜上皮细胞并过表达;β1整合素过表达能够明显增加角膜上皮细胞对各细胞外基质蛋白的黏附力并抑制角膜上皮细胞凋亡及促使MAP激酶磷酸化。结论:β1整合素过表达能有效抑制角膜上皮细胞凋亡,MAP激酶磷酸化可能在这一过程中起重要作用。

双氯芬酸钠抑制角膜上皮细胞体外增殖作用的免疫组化研究

目的从免疫组化的角度初步探讨双氯芬酸钠抑制角膜上皮细胞体外增殖的作用机理。方法选用原代及传代兔角膜上皮细胞,实验组加入双氯芬酸钠药液使其终浓度为12.5mg·L-1,对照组加入等量空白培养液,采用链霉素亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(strept avidin-biotin-enzyme complex,SABC)法检测凋亡指标的改变。结果免疫细胞化学显示加药组细胞野生型p53、Caspase-3表达增加,PCNA表达减弱。结论双氯芬酸钠可能通过诱导凋亡和细胞周期停止而发挥其抗增殖作用。

维生素A缺乏干眼病角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表达与细胞凋亡的关系研究

目的探究维生素A缺乏干眼病角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表达与细胞凋亡的关系,为干眼病发病机制的研究提供理论依据。方法 5只雄兔维生素A缺乏干眼病模型以及5只正常喂养的雄兔,分别设为观察组与对照组。采用原位末端标记及免疫组织化学方法检测两组试验动物角膜组织上皮细胞的细胞凋亡情况,并检测FasL、Fas、Bax以及bcl-2等相关基因蛋白在角膜上皮细胞中的表达,探讨维生素A缺乏干眼病角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表达与细胞凋亡的关系。结果观察组雄兔每高倍镜视野角膜组织上皮细胞凋亡数量为(4.89±1.34)个,对照组为(0.65±0.32)个,差异具有统计学意义(P<0.05);观察组每1000个角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax阳性表达细胞数量分别为(187.35±23.23)、(212.45±24.55)、(168.67±21.43)个,显著高于对照组(65.23±18.23)、(68.46±14.51)、(48.43±16.46)个,观察组每1000个角膜组织上皮细胞bcl-2阳性表达细胞数量为(54.44±16.34)个,显著低于对照组(217.43±24.13)个,差异有统计学意义(P<0.05);Fas、FasL、Bax的表达与角膜组织上皮细胞凋亡呈显著正相关(r=0.675,r=0.785,r=0.678,P=0.000),bcl-2的表达与角膜组织上皮细胞凋亡呈显著负相关(r=-0.754 P=0.000)。结论角膜组织上皮细胞凋亡可能导致角膜组织上皮细胞出现干燥、变薄,引起功能减退,导致干眼病症状,这可能与Fas、FasL、Bax表达量增多,bcl-2的表达量降低加快角膜组织上皮细胞凋亡有关。

不同浓度葡萄糖对兔角膜上皮细胞凋亡的影响

目的探讨葡萄糖不同浓度对兔角膜上皮细胞(rabbit corneal epithelial cells,RCECs)凋亡的影响。方法将离体培养的RCECs随机分为正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(33 mmol/L葡萄糖)和高渗组(5.5 mmol/L葡萄糖+27.5 mmol/L甘露醇),采用Western印迹法检测各组RCECs双链RNA依赖蛋白激酶样ER激酶(PKR like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、磷酸化双链RNA依赖蛋白激酶样ER激酶(phosphorylated PKR like endoplasmic reticulum kinase,p-PERK)、真核翻译起始因子(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)、磷酸化真核翻译起始因子(phosphorylated eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)和转录因子C/EBP同源蛋白(transcription factor C/EBP homologous protein,CHOP)表达水平;显微镜下观察不同葡萄糖浓度(200~800 mmol/L)RCECs生长情况的变化,甘露醇做渗透压对照。结果Western印迹法结果显示,与正常对照组相比,高糖组和高渗组均可诱导RCECs p-PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白表达水平升高(P<0.05),且这3种蛋白表达水平高糖组明显高于高渗组(P<0.05)。显微镜观察发现:在一定的范围(200~800 mmol/L)内,RCECs损伤面积随葡萄糖浓度的升高而增加;而葡萄糖与同浓度甘露醇相比,对RCECs损伤范围均较小。但当总浓度达到800 mmol/L时,葡萄糖和甘露醇均导致RCECs短期内大片脱落死亡,高糖与高渗致细胞损伤程度相当。结论高糖浓度依赖性诱导RCECs的凋亡,浓度越低(≤33 mmol/L),高糖较高渗对RCECs的影响越大。因此,慢性低度高糖刺激对RCECs具有累积毒性效应(渗透压改变带来的影响小),对于糖尿病性干眼的临床诊治有一定的指导意义。

枸杞多糖调控AMPK/ULK1自噬途径对高渗诱导角膜上皮细胞凋亡的影响

目的探讨枸杞多糖调控腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/不协调的51类激酶1(ULK1)自噬途径对高渗诱导角膜上皮细胞凋亡的影响。方法通过500 mOsm·L^(-1)渗透压的饱和氯化钠溶液作用于角膜上皮细胞建立眼干燥症细胞模型,分为模型组、阳性对照组(0.3%玻璃酸钠滴眼液)、抑制剂组(1 mg·mL^(-1)的枸杞多糖+10μmol·L^(-1)compound C)和低、高剂量实验组(0.5、1.0 mg·mL^(-1)的枸杞多糖),另取正常培养的CRL^(-1)1135细胞作为空白组(不进行任何处理)。用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况,用单丹磺酰戊二胺染色法检测各组细胞的自噬情况,用蛋白质印迹法检测各组细胞中磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK和p-ULK1/ULK1的表达水平。结果低、高剂量实验组和阳性对照组、抑制剂组、模型组、空白组的细胞凋亡率分别为(26.47±2.13)%、(13.68±2.21)%、(12.54±2.16)%、(18.73±2.12)%、(37.56±3.25)%和(6.35±2.14)%,自噬小体相对含量分别为(59.63±8.14)%、(89.89±9.04)%、(90.31±9.13)%、(62.75±7.26)%、(43.11±6.45)%和(100.00±0.00)%,p-AMPK/AMPK分别为0.45±0.07、0.64±0.08、0.66±0.06、0.53±0.04、0.34±0.05和0.87±0.06,p-ULK1/ULK1分别为0.54±0.06、0.75±0.05、0.77±0.03、0.65±0.04、0.46±0.04和0.92±0.08。低、高剂量实验组和阳性对照组的上述指标与模型组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);抑制剂组的上述指标与高剂量实验组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论枸杞多糖可通过激活AMPK/ULK1自噬途径抑制高渗诱导的角膜上皮细胞凋亡。

“肺与大肠相表里”的组织细胞学基础研究

目的:研究并比较人胚胎发育不同时期肺与肠上皮形态特征、上皮细胞增殖与凋亡及上皮功能蛋白的变化情况。方法:观察人胚胎发育不同时期肺与肠上皮形态;流式细胞术检测胚胎不同时期肺与肠上皮细胞的增殖与凋亡,免疫组化测定不同时期上皮细胞功能蛋白。结果:胚胎早期,肺与肠上皮形态一致,上皮细胞增殖、凋亡的无显著差异;胚胎中期、胚胎晚期肺与肠在上皮形态不一致,上皮细胞增殖、凋亡有显著差异(P<0.05)。胚胎各期肺与回肠、结肠上皮细胞功能蛋白无显著差异,而与空肠、直肠、膀胱存在显著性差异(P<0.05)。结论:肺与回肠、结肠在胚胎组织发生上存在时相上的同步性;"肺与大肠相表里"中的"大肠"大致可定位于"回肠、结肠";在胚胎早期可以为"肺"与"回肠、结肠"同源发生提供一定的依据;"肺与大肠相表里"肺肠相关虽主要是功能之间的相互联属,但可能与其原始的同源性相关。

胸腺素β4对体外培养的兔角膜上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的探讨胸腺素B4（Tβ4）对体外培养的兔角膜上皮细胞氧化损伤的影响。方法实验研究。采用组织块培养法获得原代兔角膜上皮细胞并进行传代培养。采用形态学观察和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测成熟角蛋白（keratin）12和缝隙连接蛋白（connexin）43的表达情况，对细胞进行鉴定。以H_20_2处理角膜上皮细胞制备体外细胞氧化损伤模型，并观测Tβ4对其保护作用。实验分为4组：正常对照组、Tβ4组、H20：组和H_2O_2＋Tβ4组。采用MTF比色法检测角膜上皮细胞存活度；运用TUNEL染色观察角膜上皮细胞凋亡；利用DCFH—DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平；通过划痕实验观察角膜上皮细胞的迁移运动能力。组间均数比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD—t检验。结果培养的细胞呈圆形、卵圆形和多边形，铺路石样生长；RT—PCR法检测显示培养的细胞表达角膜上皮细胞特异性基因，keratin12和connexin43，呈现角膜上皮细胞的特征。经H_2O_2刺激后，角膜上皮细胞的存活率（67．20％±5．87％）较正常对照组显著下降（100．00％±9．99％）（4个组间比较F=18．61，P=0．001，两两比较P=0．000）；H202＋Tβ4组细胞存活率（83．42％±7．43％）与H202组（67．20％±5．87％）比较明显增高（P=0．023）。4个组间细胞划痕实验结果的差异具有统计学意义（F=36．38，P=0．000），在12hTβ4组划痕已基本消失，细胞迁移率为117．6％±2．22％，与正常对照组（100．00％±4．06％）相比显著增加（P=0．005）；12h时H_20_2＋Tβ4组与H202组相比，细胞迁移率为96．57％±8．22％，与H202组（64．38％±11．08％）相比明显增加（P=0．000）。H202刺激后细胞内ROS水平为234．42％±22．15％，较正常对照组（100．00％±5．28％）明显增加（P=0．000），H_20_2＋Tβ4组细胞内ROS水平（163．26％±10．53％）虽然较正常对照组偏高，但与H_20_2组（234．42％±22．15％）比较显著降低（P=0．000）。TUNEL染色结果显示，H_2O_2组呈现较多凋亡细胞，H_2O_2＋Tβ4组与H_20_2组相比，凋亡细胞明显减少。结论Tβ4通过抑制氧化损伤后细胞内ROS的产生对氧化应激损伤后的角膜上皮细胞具有减少细胞凋亡，增加细胞存活率并促进细胞迁移的作用，提示Tβ4对角膜上皮细胞氧化损伤具有保护作用。

贝特舒对人角膜上皮细胞凋亡诱导作用的实验研究

为了揭示常用青光眼药物贝特舒（betaxol01）对人角膜上皮（HCEP）细胞的毒性及其作用机理，使用不同质量浓度贝特舒对体外培养IqCEP细胞进行了处理，并利用倒置显微镜跟踪观察了细胞的生长和形态，用吖啶橙／溴化乙锭（AO／EB）荧光双染色法检测了质膜的通透性，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的断片化，用透射电镜检测细胞的超微结构。发现在0．17500—2．80000g／L的质量浓度范围内，贝特舒对HCEP细胞具有显著的毒性。并随着质量浓度的提高和处理时间的延长而逐渐增大，处理24h即可使大部分细胞皱缩死亡；进一步的研究结果发现，质量浓度为0．17500—2．80000g／L的贝特舒能显著提高HCEP细胞的质膜通透性，并使其出现DNA断片化、染色质凝缩和形成凋亡小体等凋亡细胞的结构变化。可见，在贝特舒0．17500—2．80000g／L的质量浓度范围内对HCEP细胞具有显著的毒性，并具有质量浓度和时间依赖性，其毒性作用的发挥是通过诱导细胞凋亡实现的，在眼科I旌床应用中毒副作用极大。

BIGH3基因定点突变体R555W的构建及其对人角膜上皮细胞的影响

目的构建野生型BIGH3和突变型R555W—BIGH3基因的真核表达载体，探讨其过表达对人角膜上皮细胞的影响。方法以pMDl8．T／BIGH3载体为模板扩增野生型BIGH3基因全长编码序列，克隆至真核表达载体plRES2-EGFP上，采用快速体外定点诱变技术获得R555W突变体。瞬时转染体外培养的人角膜上皮细胞，免疫印迹检测野生与突变型BIGH3基因的表达，流式细胞仪和透射电镜定量和定性检查细胞凋亡，分析caspase3活性。多组间数据采用单因素方差分析进行统计学处理。结果PCR成功扩增了野生型和R555W突变型的BIGH3基因。荧光显微镜下可见成功转染BIGH3／R555W-BIGH3-plRES2．EGFP的CRL-11135细胞发绿色荧光，转染率为30．1％。瞬时转染48h后的HCE细胞的上清液及其细胞裂解液免疫印迹分析显示，BIGH3／R555W-BIGH3-pIRES2-EGFP两组免疫印迹条带的密度比分别为1．26±0．06和1．27±0．08。正常HCE细胞组、转染pIRES2-EGFP空质粒及BIGH3-pIRES2-EGFP细胞凋亡率分别为（1．49±0．02）％、（1．53±0．02）％、（1．50±0．06）％，转染R555W．BIGH3-pIRES2-EGFP组细胞凋亡率达到19．46％±0．08％。差异有统计学意义（F=175261．23，P〈O．01）。透射电镜下可见转染组细胞核内染色质凝集，固缩，分布于核膜下，核仁消失，有的胞核碎裂，细胞呈典型的凋亡改变。转染R555W-BIGH3-plRES2-EGFP组caspase-3活性为561．03±1．05，与其他组相比，差异有统计学意义（F=629347．38，P〈0．01）。结论应用快速体外定点诱变技术，成功获得突变型R555W．BIGH3基因，转染人角膜上皮细胞后，通过caspase3途径引起细胞凋亡。