RNA-Seq分析baeSR和acrB对鼠伤寒沙门菌相关毒力基因表达的影响

本研究旨在探索baeSR和acrB基因缺失后对鼠伤寒沙门菌相关毒力基因表达的影响。采用RNA-Seq技术筛选鼠伤寒沙门菌体外诱导环丙沙星耐药株(CR)、acrB基因缺失株(CRΔacrB)、baeSR和acrB基因双缺失株(CRΔbaeSRΔacrB)的差异表达基因,对筛选的基因进行GO富集和KEGG通路富集分析,进一步探究差异表达基因的主要功能及涉及的生物过程,并选出7个差异显著基因进行荧光定量PCR验证。结果表明CRΔacrB与CR相比较,共筛选到1 320个差异表达基因(fold change的绝对值>2,Q-value<0.005),其中上调426个,下调894个;CRΔbaeSRΔacrB与CR相比较,共筛选到1 377个差异表达基因(fold change的绝对值≥2,Q-value<0.005),其中上调405个,下调972个,两个比较组筛选到的毒力相关基因均主要富集在双组分系统、鞭毛组件、沙门菌感染和上皮细胞的细菌入侵等通路中。荧光定量PCR验证结果与RNA-Seq结果基本一致。本研究对baeSR和acrB基因在鼠伤寒沙门菌毒力中的作用进行了初步分析和探索,为进一步研究鼠伤寒沙门菌致病机制奠定基础。

鼠伤寒沙门菌baeSR和acrB双基因缺失株相关耐药基因的RNA-seq分析

应用转录组测序技术(RNA-seq)筛选鼠伤寒沙门菌baeSR和acrB相关的靶基因,为鼠伤寒沙门菌耐药机制的深入研究奠定基础。采用RNA-seq技术分析baeSR和acrB基因缺失后表达量变化的相关耐药基因,通过GO富集和KEGG通路探索其主要功能,qRT-PCR验证部分差异基因。以|log2(Fold Change)|>1且q value<0.005为条件,其中以CR△acrB和CR为比较组,共筛选到1320个差异表达基因,894个下调,426个上调;以CR△baeSR△acrB和CR为比较组,共筛选到1377个差异表达基因,972个下调,405个上调。GO富集分类结果显示差异基因主要集中在跨膜运输、细胞黏附、纤毛或鞭毛运动等功能;KEGG数据库显示,差异基因主要富集在代谢途径、ABC转运系统、双组份信号转导系统、鞭毛组装、β-内酰胺抗性等通路。其中,ompR、csgD、fliA、fliG可通过调节细菌生物膜形成能力调控其对多种抗生素的耐药性;emrA、mdtC、yejE属于外排泵相关基因,可介导细菌对黏菌素、新生霉素等的耐药性;STM3031可赋予沙门菌头孢曲松抗性;pmrF可参与调节细菌对多粘菌素的抗性。鼠伤寒沙门菌acrB和baeSR基因缺失可影响相关耐药基因的表达。

鼠伤寒沙门菌BaeSR对氟喹诺酮类药物耐药性的调控机制

BaeSR是鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)中重要的双组分系统(two component system,TCS),通过调控下游靶基因的转录表达影响细菌的耐药性。本研究旨在探索BaeR过表达后,鼠伤寒沙门菌BaeSR对氟喹诺酮类药物(FQs)的耐药调控机制,寻找BaeR潜在靶基因。首先表达BaeR蛋白并纯化与验证,选取从转录组学筛选到的与耐药相关的差异表达基因(包括ompW、sodB、tolC、mdtD、spy和marR)作为BaeR潜在靶基因,结合LacZ报告基因融合试验及凝胶阻滞试验(EMSA)探究BaeSR对鼠伤寒沙门菌的耐药调控机制。结果显示:经纯化验证后,在28 ku处出现目的条带,表明BaeR蛋白成功表达。LacZ报告基因融合试验结果表明,BaeR过表达后可以正向调控ompW、sodB、tolC、mdtD、spy和marR的表达。EMSA结果表明,BaeR蛋白可以直接结合到marR的启动子区,调控marR基因的表达。在鼠伤寒沙门菌中,BaeSR可以通过正向调控靶基因ompW、sodB、tolC、mdtD、spy和marR的转录表达并直接调控marR的表达,从而影响菌株对FQs的耐药性。

鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失株的构建及其对抗生素敏感性分析

【背景】沙门菌的多重耐药现象日渐严重,对其耐药机理的研究尤为迫切,双组分系统与细菌耐药性密切相关。【目的】构建鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失株及回补株,探究双组分系统BaeSR对鼠伤寒沙门菌耐药性的影响。【方法】以鼠伤寒沙门菌体外诱导耐药株CR为研究对象,通过自杀质粒p LP12介导的同源重组方法,以氯霉素抗性标记和阿拉伯糖诱导的致死基因vmt进行正、反向双重筛选,获得基因缺失株CRΔbaeSR,并将重组表达质粒pBAD-baeSR转化于CRΔbaeSR构建回补株CR CΔbaeSR。采用微量肉汤稀释法测定11种常见代表药物对野生株、缺失株及回补株的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),并测定3株菌的生长曲线、运动性及生物膜形成能力。【结果】与野生株相比,环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)、头孢噻呋(CEF)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、安普霉素(APR)对缺失株的MIC值有所下降;缺失株的生长速率稍显缓慢,且最终浓度也相对较低,但并无统计学上的显著差异(P>0.05);缺失株的运动性(P<0.05)及生物膜形成能力(P<0.01)均显著下降。【结论】鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失后,可通过影响其运动性及生物膜形成能力而对抗生素的敏感性产生影响。

鲍曼不动杆菌双组份系统调控AdeABC外排泵表达的研究

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是一种革兰阴性菌(Gram negative bacterium),是引发院内感染的主要致病菌之一。AB耐药机制复杂,其中AdeABC外排泵是AB的主要耐药机制之一。双组份系统(two component system, TCS)是AB的信号转导系统,TCS AdeRS和TCS BaeSR可以调控AdeABC外排泵表达,有很大潜力成为AB的抗菌药物靶点。现就TCS对AdeABC外排泵的调控机制及TCS抑制剂的研究进展作一概述。