一株链霉菌的鉴定及其产bafilomycin A1的发酵工艺研究

提高链霉菌FIM-B0711发酵液中的抗肿瘤成分bafilomycin A1含量,通过对FIM-B0711的形态学、培养特征、生理生化分析及16S r DNA分析鉴定菌株。经鉴定FIM-B0711为灰褐色链霉菌(Streptomyces griseobrunneus)。并确定了最优的发酵培养基(g/L):可溶性淀粉40、蛋白胨30、酵母粉20、玉米浆15、Ca Co32;最优摇瓶发酵条件:接种量5. 0%,发酵周期96 h,500 m L摇瓶装量100 m L,培养温度28℃,摇床转速220 r/min,培养基初始p H值为7. 0。优化后发酵工艺bafilomycin A1的发酵产量较初始工艺提高了约344%。

Streptomyces bacillaris ATCC 15855~T中bafilomycin A1合成基因簇的挖掘

Bafilomycin A1是大环内酯类抗生素,具有广泛的抗癌活性。通过HPLC及HPLC-MS分析Streptomyces bacillaris ATCC 15855^T的发酵产物,结果显示S.bacillaris ATCC 15855 T发酵能够产生bafilomycin A1。S.bacillaris ATCC 15855^T分离自中亚土壤。通过全基因组测序,获得了S.bacillaris ATCC 15855^T的完整基因组序列。该基因组由6957417 bp的线性染色体组成,GC含量为72.29%。该染色体预测了7284个开放阅读框架(ORF),18个rRNA操纵子,64个tRNA基因。通过antiSMASH v 4.0.3分析,共预测了39个生物合成基因簇。其中,具有抑制液泡型H(+)ATP酶的bafilomycin A1基因簇与已报道的基因簇相似度为100%。在bafilomycin A1合成基因簇中有19个ORFs。

巴弗洛霉素A1对脑缺血再灌注损伤作用的初步研究

目的:探讨预防性给予SD大鼠巴弗洛霉素A(Bafilomycin A1,Baf A1)对局部脑缺血再灌注损伤(middle cerebral artery occlusion-reperfusion,MCAO/R),是否神经保护作用及初步机制研究.方法:健康雄性SD大鼠80只,随机分为:假手术组(sham)、对照组(Saline)、氟西汀组(Fluo)和Baf A1组.Fluo组和Baf A1组大鼠于术前分别给予氟西汀混悬液(2.0mg-1kg^(-1)d^(-1))灌胃和Baf A1(1.0mg-1kg^(-1)d^(-1)),连续14d;sham组和Saline组均于术前14天开始给予等体积生理盐水.再灌注24h后,进行神经神经功能相关检测,并用TTC染色法计算脑梗死面积,并提取新鲜脑组织总蛋白采用Western blot检测自噬相关蛋白Beclin 1的表达.结果:Baf A1可显著降低大鼠脑缺血再灌注后神经功能损伤症状,减少脑梗死面积,并降低自噬相关蛋白Beclin 1的表达.结论:Baf A1对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用,可能是通过降低自噬性死亡实现的.

巴弗洛霉素A1抑制前列腺癌转移的初步探讨

目的通过检测前列腺癌细胞中质子泵V-ATPase酶的相关基因和相关蛋白的表达,探讨V-ATPase酶抑制剂巴弗洛霉素A1在治疗前列腺癌转移中的潜在价值。方法检测前列腺癌细胞系PC3细胞中质子泵V-ATPase酶相关基因和相关蛋白表达水平;在此基础上,使用巴弗洛霉素A1刺激PC3细胞,观察前列腺癌细胞增殖、迁移和细胞内酸化等生物学行为变化。结果质子泵V-ATPase酶V-ATPaseV1A1、V-ATPase V1E和V-ATPase V0A1亚单位在PC3细胞内表达高于人骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞组,差异均有统计学意义(t分别=-13.78、-19.33、-13.45,P均<0.05)。利用V-ATPase酶抑制剂巴弗洛霉素A1(10 nmol)处理96 h,仅有12.00±3.00%的前列腺癌细胞增殖,差异有统计学意义(t=37.17,P<0.05)。与此同时,利用2.5 nmol巴弗洛霉素A1处理时,发生迁移的前列腺癌细胞数量从对照组的(233.33±20.55)个/孔,下降为(105.00±7.02)个/孔迁移,差异有统计学意义(t=8.07,P<0.05)。进一步分子生物学机制分析表明,2.5 nmol巴弗洛霉素A1可完全抑制V-ATPase介导的酸化。结论应用巴弗洛霉素A1可使前列腺癌细胞酸化受影响,从而抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移功能。

巴佛洛霉素A1介导AMPK/mTOR/ULK1信号通路对脑缺血再灌注损伤小鼠的神经保护机制研究

目的探讨巴佛洛霉素A1(BAF-A1)抗小鼠脑缺血再灌注(IR)损伤的腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/Unc-51样激酶1(ULK1)自噬信号通路的机制。方法选择SPF级雄性小鼠40只,采用随机数表法分成假手术组(S组)、IR模型组(M组)、BAF-A1组(B组)、BAF-A1+AMPK激动剂组(B+M组),每组10只。以线栓法制备IR模型,以缺血1.5 h再灌注24 h后为评价点进行评价。结果神经功能缺失评分显示,S组无神经功能缺失,B组为(1.47±0.28)分、B+M组为(2.05±0.16)分、M组为(2.45±0.31)分,B组及B+M组均低于M组(P<0.05)。与M组比较,B组脑梗死体积比率下降(P<0.05)。与S组比较,M组CA1、CA3区有少量的核固缩核裂变、坏死的现象;与M组比较,B组CA1、CA3区的核固缩,核裂变空泡及坏死的症状改善,但B+M组拮抗了这一作用。与S组比较,M组LC3Ⅱ/Ⅰ、p-AMPK/AMPK蛋白均升高(P<0.05);与M组比较,B组LC3Ⅱ/Ⅰ、p-AMPK/AMPK蛋白均下降(P<0.05)。与S组比较,M组p-mTOR/mTOR、Ps757-ULK1/ULK1蛋白降低;与M组比较,B组p-mTOR/mTOR、Ps757-ULK1/ULK1蛋白均升高(P<0.05)。结论BAF-A1可能通过抑制AMPK/mTOR/ULK1信号通路,抑制小鼠脑海马区的过度自噬,从而发挥神经功能的保护性作用。

大鼠大脑皮质神经细胞氧糖剥夺再复氧(OGD/R)后自噬对凋亡的抑制作用

目的 观察大脑皮质神经元氧糖剥夺再复氧(OGD/R)后自噬对凋亡的影响。方法 取18只出生在24 h内的新生SD大鼠,采用机械分离胰蛋白酶消化法提取大脑皮质神经元培养7 d后,建立OGD/R模型,随机分为3组,正常对照组、OGD/R组、OGD/R联合巴弗洛霉素A1(BafA1)组。采用CCK-8法和乳酸脱氢酶(LDH)实验检测细胞活力,用异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡,采用反转录PCR法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 P62及胱天蛋白酶3(caspase-3)的mRNA表达,Western blot法检测LC3、 P62及caspase-3的蛋白表达。采用红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-LC3(RFP-GFP-LC3)腺病毒转染神经细胞检测自噬荧光强度,透射电子显微镜观察自噬体的超微结构变化。结果 与对照组相比,OGD/R组神经细胞活力明显降低,LDH释放水平明显升高,凋亡增加;LC3、 P62、 caspase-3的mRNA和蛋白表达增强;RFP荧光强度增加,自噬体增加且自噬溶酶体更加聚集,加用自噬晚期抑制剂BafA1后RFP荧光强度显著降低。结论 OGD/R诱导了神经元细胞的自噬和凋亡,抑制自噬后加重了神经细胞的损伤和凋亡。

HPLC法测定Streptomyces sp.发酵液中bafilomycin A1的含量

目的:建立放线菌Streptomyces sp.发酵液中bafilomycin A1的鉴别及含量测定的方法。方法:采用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS)分析技术进行定性鉴别;采用高效液相色谱法(HPLC法)进行含量测定,使用Ultimate LP-C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为甲醇-水(85∶15),流速1.0 mL·min^(-1),检测波长247 nm,柱温40℃。结果:bafilomycin A1质量浓度在18.75～600μg·mL^(-1)范围内线性良好,相关系数为1.0(n=6);平均回收率为101.4%,RSD为1.3%(<2.0%);方法的精密度RSD为1.2%。3批发酵样品中bafilomycin A1含量分别为183.69、196.29、198.63μg·mL^(-1),均在有效测定范围内。结论:本方法可以用于bafilomycin A1发酵、提炼及纯化过程的含量测定。

β-淀粉样蛋白Aβ_(25-35)诱导HT22细胞自噬及其对V-ATPase表达的影响

【目的】探讨β-淀粉样蛋白Aβ25-35诱导HT22细胞产生自噬及与V-ATPase变化的关系。【方法】将HT22细胞分为对照组、无血清培养组、Aβ处理组和Aβ+Bafilomycin A1组,不同浓度的Aβ25-35作用于HT22细胞24 h,用CCK8测定细胞活力变化,免疫细胞荧光检测自噬斑点变化,及Western blot检测LC3、V-ATPase蛋白变化。【结果】Aβ可以诱导HT22细胞出现明显的自噬现象,且这种自噬同Aβ的浓度以及作用时间具有一定的相关性。V-ATPase的表达伴随自噬的增多也逐渐增多。Bafilomycin A1可以进一步诱导V-ATPase增加,增加细胞内自噬体的聚积。【结论】Aβ25-35可诱导HT22细胞产生自噬,且与V-ATPase表达有关。

抑制自噬增强MCF-7乳腺癌细胞对依托泊苷的敏感性

目的探讨自噬抑制剂(Baf)在乳腺癌MCF-7细胞对依托泊苷(VP-16)的药物敏感性的影响。方法实验分为对照组(NC)、Baf组、VP-16和VP-16+Baf组。用MTT法检测细胞生存活力、GFP-LC3质粒转染后荧光显微镜检测绿色荧光的分布、Western blot检测蛋白表达和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 15μmol/L的VP-16使细胞活力降低,而在收集细胞前12 h时加入10 nmol/L的Baf进一步降低了细胞活力(P<0.01);VP-16明显增加MCF-7细胞的LC3Ⅱ的表达和GFP-LC3绿色荧光斑点的聚集,而减少了P62的蛋白表达;与VP-16组比较,VP-16+Baf组细胞P62的蛋白表达增多,凋亡蛋白cleaved-PARP的表达和细胞凋亡比例也明显增多(P<0.01)。结论 VP-16抑制乳腺癌细胞增殖的过程中诱导了保护性自噬,抑制自噬促进了凋亡性死亡,可以增加癌细胞对VP-16的敏感性。

细胞自噬缓解氧-糖剥夺诱导原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤

目的在离体细胞水平,探讨氧-糖剥夺(OGD)致原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤过程中,细胞自噬的变化情况和可能作用。方法出生24 h内C57BL/6J乳鼠脑皮质神经元原代培养7 d后,分为常氧(Nor.)、15、30、60、90和120 min OGD后24 h复糖复氧等6组,每组n=6;免疫印迹(Western blot)法检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ比值;借助MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,检测神经元的损伤;用细胞自噬下游抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf A1100 nmol/L)抑制自噬后,观察神经元的损伤。结果与对照组相比,随OGD时间的延长,自噬相关蛋白Beclin-1表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,30 min达到峰值,之后略有回降(P<0.05);在OGD处理30和60 min致使神经元显著损伤的基础上,细胞自噬抑制剂Baf A1可明显加重60 min OGD处理神经元的损伤和提高LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(P<0.05)。结论 OGD可诱发原代培养小鼠脑皮质神经元自噬发生,且细胞自噬可缓解OGD处理皮质神经元的缺血损伤。

链霉菌BAF-0711产生的抗肿瘤活性成分的分离纯化和结构鉴定

探讨分离、纯化和鉴定链霉菌BAF-0711发酵液中的抗肿瘤活性成分的方法。采用大孔吸附柱层析、硅胶柱层析等方法对该菌株的次级代谢产物进行分离纯化;根据理化性质和波谱学方法进行化学结构的鉴定;利用MTT法来检测化合物的抗肿瘤活性。从该菌株发酵液中分离到化合物BAF-0711-A。经波谱方法鉴定与文献中报道的bafilomycin A1同质。以拉帕替尼为对照,BAF-0711-A对乳腺癌细胞MB-45-3d有较强的增殖抑制活性,其IC50值为0.217μmol/L。

巴弗洛霉素A1体外广谱抗冠状病毒作用研究

目的寻求针对SARS-CoV-2、PEDV、TGEV等冠状病毒的广谱抗病毒药物,保障公共卫生安全。方法在细胞水平上评价内体酸化抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,Baf-A1)对SARS-CoV-2、PEDV、TGEV 3种冠状病毒的抗病毒效果。其中,SARS-CoV-2的相关试验在其易感细胞Vero E6和Caco-2细胞上进行,PEDV的相关试验在易感细胞Vero E6细胞上进行,TGEV的相关试验在易感细胞ST细胞上进行。通过结晶紫染色试验和CCK8(Cell Counting Kit-8,细胞计数试剂)评价Baf-A1对细胞的毒性作用,通过病毒滴度测定、RT-qPCR检测和CCK8试验评价Baf-A1对SARS-CoV-2、PEDV、TGEV等冠状病毒的抗性。结果12.5μmol/L的Baf-A1表现出对Vero E6细胞的毒性作用,能显著抑制Vero E6细胞增殖,而Baf-A1对Caco-2细胞和ST细胞的毒性作用浓度分别为2.5μmol/L和1.0μmol/L及以上。Baf-A1在0.5μmol/L可抑制SARS-CoV-2在Vero E6细胞和Caco-2细胞中的复制,显著提高接毒细胞的存活率;0.02μmol/L的Baf-A1可抑制PEDV感染Vero E6细胞,提高该细胞存活率;0.04μmol/L的Baf-A1可抑制TGEV在ST细胞中复制,提高ST细胞存活率。结论Baf-A1具有对SARS-CoV-2、PEDV、TGEV等冠状病毒的广谱抗病毒效果。

巴弗洛霉素A1抑制卵巢癌细胞SKOV3自噬并增强化疗敏感性的作用机制

目的:研究巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)对5-氟尿嘧啶(5-FU)作用下的卵巢癌细胞SKOV3自噬的抑制作用及其增强化疗敏感性的可能机制。方法:将SKOV3细胞随机分为3组,A组:50μmol/L5-氟尿嘧啶(5-FU)处理48h;B组:100nmol/L巴弗洛霉素A1给药1h后加入50μmol/L5-FU处理48 h;C组(阴性对照):不作任何处理。3组细胞均应用吖啶橙染色、间接免疫荧光技术检测卵巢癌细胞SKOV3自噬形态学变化;并通过Western blotting检测巴弗洛霉素A1对SKOV3细胞中微管相关蛋白轻链3(LC3)及自噬相关蛋白Beclin1表达的影响。结果:B组产生的红色酸性区域明显减少,LC3定位的荧光亮度减弱,细胞内LC3、Beclin1蛋白表达量显著降低。结论:巴弗洛霉素A1可能通过减少SKOV3细胞酸性区域的数量,抑制LC3产生从而抑制SKOV3细胞的自噬。