苹果柱型基因的ISSR分子标记研究

以普通型苹果品种‘富士’和柱型苹果‘舞姿’以及其杂交后代的柱型与非柱型实生苗为试材 ,建立了苹果的ISSR (Inter SimpleSquenceRepeatpolymorphicDNA)分子标记体系 ,并将ISSR标记用于苹果柱型基因Co的遗传分析。结果表明 ,在 2 0 μL反应体系中各组分的用量为TaqDNA聚合酶 1U、Mg2 + 的浓度为 2 5mmol·L-1 、模板DNA用量 2 0ng、引物浓度 0 2 μmol·L-1 及退火温度 52℃ ,80 %引物具有良好的扩增能力。调整模板DNA的用量、引物浓度及退火温度能够优化苹果ISSR -PCR扩增体系。从所筛选的 6 5个引物中获得了 35个ISSR标记 ,其中 33个标记呈现 1∶1分离 ,可用于苹果柱型基因的遗传分析。

一个与苹果柱型基因Co连锁的RAPD标记

以短枝富士 spur-typeFuji ×舞姿 Telamon 的F1群体 共106株 为试材,利用RAPD技术,结合集群分类分析法,进行了苹果柱型基因 Co 连锁的分子标记研究.获得了与Co基因连锁的RAPD标记S1065-437.该标记与Co位点的连锁距离为8.66cM.

苹果柱型基因Co的一个AFLP标记的SCAR转换

将苹果柱型基因的一个AFLP标记成功地转换成了简单实用的SCAR标记。首先对AFLP标记片段进行序列测定 ,然后根据序列特点设计了两对特异引物CoA1/CoA2 和CoA1/CoA3 ,每条引物长 2 0bp。PCR结果表明CoA1/CoA2 可以扩增出 2 16bp和 148bp两条带 ,其中 2 16bp的为柱型性状的特征带 ;CoA1/CoA3 可以扩增出 2 73bp和 2 0 5bp的两条带 ,其中 2 73bp的为柱型性状的特征带。两对引物在杂交后代中扩增出的特征带与柱型性状的分离重组率都很低 (CoA1/CoA2 为 6 .3%± 2 .5 % ;CoA1/CoA3 为 7.3%±2 .6 % ) ,所以它们都可以作为该SCAR标记的特异引物所用。

与苹果柱型基因(Co)相关的AFLP标记片段的克隆

Co基因是与苹果树体生长习性有关的一个主基因，是培育树体紧凑型苹果品种的一个十分重要的基因资源，所以，Co基因分子标记的研究对苹果育种具有重要价值。用PCR的方法将以短枝富士×舞姿的F1分离群体为试材筛选到的一个与Co基因连锁较为紧密的AFLP标记成功地进行了再扩增，同时也实现了此标记片段的克隆和转化。这一研究结果对该AFLP标记向SCAR标记的转换具有重要意义。

柱型苹果叶片的解剖学研究

利用常规的石蜡切片法,对苹果品种舞姿(柱型)、短枝富士、普通富士以及舞姿×短枝富士的实生后代的叶片结构进行解剖比较研究。结果表明,柱型苹果在叶片总厚度和栅栏组织厚度上明显有别于其他2种类型,表现为:柱型>短枝型>普通型;柱型苹果的海绵组织厚度与其他2种类型无显著差异。普通型苹果的叶片栅栏组织细胞一般排列成2层,其栅栏组织与海绵组织的厚度比值小于1;而柱型和短枝型的栅栏组织细胞通常排列成3层或4层,其栅栏组织与海绵组织的比值大于1,而且,随着矮化程度的加强,栅栏组织细胞层数和栅/海比有增加趋势。

利用cDNA-AFLP技术研究苹果柱型与非柱型cDNA的差异表达

以苹果(Malus×domesticaBorkh.)柱型品种舞姿、非柱型品种富士及其杂交F1群体中柱型、非柱型单株为研究试材,应用cDNA-AFLP(cDNA-amplified fragment length polymorphism)技术,研究柱型与非柱型苹果cDNA的差异表达,探讨了苹果柱型基因Co表达的分子机制。通过64对引物组合的cDNA-AFLP分析获得了1630条在柱型与非柱型苹果中差异表达的片段。经过BSA(bulked segregant analysis)分析和反向Northern杂交鉴定,获得了11个差异表达的cDNA片段,并进行了克隆、测序和序列同源性检索分析。有5个片段在GenBank数据库中发现同源序列,其余的6个功能未知。核酸和氨基酸比对分析中同源性最高的是片段A7和A16。A7的核苷酸序列同源于红叶石楠Photinia fraseri26S核糖体RNA(97%)、蛋白同源于玉米的细胞色素P450单加氧酶(91%),A16的核苷酸(85%)及蛋白(93%)同源于直果草属Triphysaria versicolor的α-expansin2基因。对A7、A16两个候选基因片段再进行正向Northern杂交验证,在富士中表达最强,在非柱型后代、柱型后代及舞姿中表达依次减弱。由此推断,由细胞色素P450单加氧酶基因所调控的赤霉素GAS变化影响了苹果柱型性状的表达。

威赛克柱型苹果与旭的AFLP多态性研究

以旭和威赛克等 8个柱型苹果品种 (品系 )为试材 ,建立了AFLP银染技术体系。经过引物筛选 ,发现引物PstI GAC/MseI TA和PstI GAC/MseI CG可分别在旭和威赛克之间各扩增出 1条特异片段 ,初步认为这两条特异片段可能与苹果柱型Co基因相关。

柱型苹果杂交后代果实性状遗传

对威赛克(Wijcik)与嘎拉(Gala)杂交后代的植株类型及果实的成熟期、大小、形状、色泽、风味和质地的研究结果表明,威赛克与嘎拉正反交组合中,杂交后代植株柱型株型符合1∶1的分离比例,亲本成熟期具有较强的遗传力,果实大小大多数倾向于亲本类型,果形大多数表现为圆锥形,亲本果面片红遗传力较强,果实风味遗传变异较大且分离较广泛,果实质地表现为双亲型和中间型,以中间型的比例较高。

柱型苹果品种选育研究(英文)

柱型苹果品种选育项目始于1994年,旨在将苹果柱型生长习性与其它优良性状结合起来。结果表明:杂种后代的生长势、早实性,对白粉病、轮纹病和绵蚜的抗性等与杂交组合有关。果实大小、果形、果肉硬度、风味品质、花期和果实成熟期为多基因控制的性状。筛选出了一个柱型基因(Co)的AFLP标记并成功地将其转为SCAR标记,其可以用于柱型苹果杂种的早期选择。几个优系的田间实验正在进一步进行中。

矮化型、短枝型和柱型苹果苗枝芽特性和叶片特征比较

为加深对苹果各种生长型的认识,以矮化型(长富2号/M26)、短枝型(福岛短枝)和柱型(鲁加6号)3种苹果生长型嫁接苗为试材,对其枝、芽和叶片的特征进行比较研究。结果表明,三者在株高上有极显著差异,矮化型>短枝型>柱型,但在主干粗度方面差异不显著;主干节间的差异也很明显,3种类型之间差异均达到极显著水平,矮化型最高,而柱型最低;在萌芽率和成枝力方面,柱型萌芽率最高,成枝力最低,而矮化型的萌芽率最低,成枝力最高,差异均达极显著水平;在叶片特征上,柱型品种的叶面积及叶长、叶宽均显著大于其他两种,而短枝型叶片的单位面积干、鲜质量均极显著高于其他两种类型。

柱型苹果几个形态指标的遗传研究

本文对柱型苹果"舞姿"×"富士"的774株杂种二年生实生苗的柱型性状及节间、高粗比(一年生枝长度和5cm 处粗度之比)、叶型指数(叶长比叶宽)、叶序等进行了详细的调查和统计分析。研究表明:用节间(<1.13)和高粗比(<1.06)对柱型苹果早期预选的准确率达98%。

柱状苹果树生长生理与蒸散特征对水分的响应研究

通过研究不同灌水量和地表覆膜条件对柱状苹果树的生长生理及蒸散特征的综合影响，探寻适合苹果树生长且水分利用效率高的灌水量和保水措施。通过遮雨棚下可称量式蒸渗桶试验，设置4个灌水水平：60%ETC（W1）、80%ETC（W2）、100%ETC（W3）和120%ETC（W4）；地表覆膜处理分别为有覆盖（M）和无覆盖（NM），分析柱状苹果树的干物质量、光合速率、蒸腾速率和阶段耗水情况对不同灌水量和地表覆盖条件的响应规律。结果表明，干物质量随灌水量增加而增加，且M处理可促进干物质量的积累；净光合速率、蒸腾速率和气孔导度均随着灌水量的增加而升高。不同生育期净光合速率和蒸腾速率由大到小依次均为：果实膨大期、果实成熟期、开花座果期、叶变期。相同灌水量和地表覆盖处理条件下，不同时刻净光合速率由大到小依次为10：00、13：00、08：00，蒸腾速率由大到小依次为13：00、10：00、08：00，气孔导度由大到小依次为10：00、08：00、13：00。瞬时水分利用效率（LWUE）最大值和最小值分别出现在W2处理10：00（4.52μmol/mmol）和W4处理13：00（2.62μmol/mmol）；全生育期总蒸散量随着灌水量增加而增加，NM处理较M处理增加11.02%~16.35%。开花座果期、果实膨大期、果实成熟期和叶变期的耗水强度分别为3.29~4.36mm/d、2.40~4.85mm/d、0.83~1.79mm/d和0.77~1.53mm/d，耗水模数分别为19.34%~27.40%、55.99%~61.41%、8.62%~12.63%和5.85%~7.24%。最终得出120%ETC灌水量和地表覆膜条件有利于改善柱状苹果树的生长和生理状况，但80%ETC处理水分利用效率最高。地表覆膜不仅促进苹果树生长而且降低了土壤蒸发量，具有一定的保水作用。因此，MW2处理为相对节水的灌溉模式。

植物生长调节剂对芭蕾苹果组培苗内源激素含量的影响

与金冠和金矮生相比，芭蕾苹果的组培苗生长速率低，茎干粗壮；对ＰＰ３３３、ＮＡＡ和ＢＡ反应不敏感，内源激素含量变化幅度和生长速率均小于普通型和短枝型，而对ＧＡ３的反应很强，内源激素含量的变幅大。由此推证，芭蕾苹果的柱型生长习性取决于高ＩＡＡ、ＣＴＫ和低ＧＡ３含量，以及各激素间的平衡关系。

柱型苹果MADS-box家族的2个同源基因克隆与生物信息学分析

基于笔者前期进行的柱型苹果转录组测序(RNA-seq)结果,采用RT-PCR方法,从柱型苹果花芽中克隆了MADS-box基因家族的2个同源基因,分别命名为MdSOCla和MdSOClb。分析结果表明,MdSOCla开放阅读框长度为708 bp,编码235个氨基酸,蛋白质分子量为26.95 kDa,等电点为9.13;MdSOClb开放阅读框长度为717 bp,编码238个氨基酸,蛋白质分子量为27.49 kDa,等电点为9.61。MdSOCla和MdSOClb的编码区碱基序列相似性为83.49%,氨基酸的相似性为73.72%。MdSOCla和MdSOClb的第1～75个氨基酸为高度保守的MADS盒结构域,第105～170个为K盒结构域。在构建的SOC1系统进化树中,MdSOCla与MdSOClb与苹果SOC1关系最近,其次为橙SOC1,与拟南芥SOC1同源基因进化关系最远。苹果、橙、大岩桐关系较近而聚为一类,而大豆、豇豆、葡萄、拟南芥、草莓和玉兰聚为一类。蛋白质二级结构预测显示,MdSOCla蛋白有8个α-螺旋,5个β折叠区,13个β-转角;而MdSOClb蛋白有11个α-螺旋,7个β折叠区,11个β-转角。推测二者在花的发育中可能起不同的调控作用。

柱型苹果杂种实生苗几个形态指标与柱型性状的关系

对富士×舞姿的60株3年生苹果杂种实生苗的叶面积、叶鲜重、叶片数目、节间长度、高粗比与柱型性状的关系进行了统计分析。结果表明:本组合中柱型类型具有较大的叶面积和叶鲜重,具有较多叶片,节间短,高粗比比值高。叶面积、叶鲜重、叶片数目、节间和高粗比可以作为普通型早期淘汰的参考指标,但不可作为中间型早期淘汰的参考指标。

“金冠×舞乐”苹果杂种后代几个形态指标的分析

本文对“金冠×舞乐”的 2 19株三年生杂种实生苗的柱型性状等多种性状进行了调查和统计分析。结果表明 :后代柱型和非柱型性状植株呈 1∶1分离 ;节间长度、高粗比、叶形指数、萌芽数、成枝数都与柱型性状有相关性 ,可以作为柱型性状植株预先选择的指标 ;按节间长度 <1.6 7cm、高粗比 >0 .80、叶形指数 >1.6 4、萌芽数 >11、成枝数 <3.6来预选柱型性状植株准确率可达 80 %以上 ;成枝角度则不能作为柱型植株的预选指标。

农杆菌介导柱型苹果“鲁加6号”遗传转化体系的建立

本研究以柱型苹果"鲁加6号"试管苗叶片外植体为转化材料,以卡那霉素抗性基因为选择标记,建立了根癌农杆菌介导的柱型苹果"鲁加6号"苹果的遗传转化体系。研究结果表明:在MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.05mg/L培养基上,叶片不定芽分化阶段Km的选择压力为20mg/L,不定芽生根阶段Km的选择压力为15mg/L,脱菌培养阶段头孢霉素的适宜浓度为300mg/L。在农杆菌介导的遗传转化过程中,外植体经过36h预培养,侵染10min,共培养48h时,有利于提高遗传转化效率,获得的抗性愈伤组织和抗性芽数均最高。获得的Km抗性植株经PCR检测,扩增出特异条带,初步证明目的基因已整合到苹果基因组DNA中。

苹果柱型性状的SRAP分析

为了更深入研究苹果柱型基因,为苹果树型性状改良奠定基础,以舞姿与富士杂交的F1代群体为材料,利用SRAP分子标记技术与BSA法相结合的方法分析了苹果柱型性状。筛选出了1对SRAP引物组合M10E4,其在柱型池与普通型池间表现出分离,分离片段约为310bp。选用柱型与普通型的极端类型进行验证,柱型群体中多数单株都出现此片段,有2株出现交换,普通型群体中有3株出现交换,交换率为7.14%,用Mapmaker/Exp3.0软件对标记与目标性状进行连锁分析,测算遗传距离为7.7cM,并将此标记命名为M10E4-310。研究结果表明,利用SRAP技术初步找到了与柱型基因连锁较紧密的标记位点。

柱型苹果和矮生型梨组培苗叶片表皮结构研究

以柱型和普通型苹果各3个品种,矮生型和普通型梨各3个杂种实生苗的组培苗为试材,用扫描电镜观察其叶片表皮结构。结果表明,供试苹果和梨组培苗叶片上表皮细胞均为不规则的多边形,排列无方向性,上表皮无气孔分布。柱型和普通型苹果的上表皮细胞平均密度分别为2986个·mm-2和2087个·mm-2;矮生型和普通型梨的上表皮细胞平均密度分别为2633个·mm-2和1635个·mm-2。柱型苹果和矮生型梨的上表皮细胞密度分别显著高于其普通型。苹果和梨组培苗叶片下表皮气孔分布密集,气孔类型均为无规则型。柱型和普通型苹果的气孔平均长×宽分别为23.21μm×19.58μm和24.17μm×22.96μm,气孔密度平均分别为401.17个·mm-2和262.50个·mm-2;而矮生型和普通型梨气孔平均长×宽分别为29.57μm×20.30μm和26.93μm×24.51μm,气孔密度平均分别为265.67个·mm-2和158.00个·mm-2。柱型苹果、矮生型梨和其普通型之间的气孔长度差异不明显,而气孔宽度均显著小于其普通型,气孔密度均显著高于其普通型。