Protein Extraction Methods for Two-Dimensional Electrophoresis from Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek Leaves-A Medicinal Plant with High Contents of Interfering Compounds

Protein extraction is a critical step for two-dimensional electrophoresis （2-DE）. Different plant samples require different and adaptive protein extraction protocols. The leaves of medicinal plant, Baphicacanthus cusia （Nees） Bremek are notoriously recalcitrant to common protein extraction methods due to high levels of interfering compounds （especially the secondary metabolites and pigments）. This study was aimed to establish a routine procedure for the proteomic analysis ofB. cusia leaves, and a new protocol for the protein extraction was developed by optimizing trichloroacetic acid （TCA）/ acetone extraction method. The efficiency of this protocol was demonstrated by comparison with 3 published protein extraction methods （chloroform/acetone, Mg/NP-40, Tris-base/acetone）. The results showed that the optimized TCA/ acetone precipitation extraction method gave a relatively high protein yield （9.263 mg g^-1 fresh weight）, high-resolution separation, clear protein profiles, the highest proteins spots （1 31 t protein spots）, and displayed less contamination in 2- DE gels. Therefore, the results suggested that the optimized TCA/acetone method was the most effective among the 4 methods for B. cusia leaves.

不同纯度靛蓝提取物的制备及其抑菌活性研究

在建立靛蓝含量分析方法的基础上,构建了一种新型高效方法制备高纯度靛蓝,并研究了不同靛蓝粗提物和高纯度靛蓝的抑菌活性。以马蓝叶为原料,通过水提取、加碱打花、酸中和以及氢氧化钠除杂等步骤得到了3种不同靛蓝质量分数(3.06%、20.13%、22.16%)粗提物样品1~样品3;在此基础上,利用单因素试验和Box-Behnken响应面设计法优化葡萄糖还原工艺得到了高纯度靛蓝样品4;最后,采用牛津杯法比较了3种靛蓝粗提物和高纯度靛蓝对黑曲霉、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性。结果表明:葡萄糖还原工艺最佳条件为葡萄糖质量浓度25 g/L、NaOH质量浓度26.9 g/L、反应温度60℃和反应时间30 min;在此最佳工艺条件下,可得到纯度为96.87%的高纯度靛蓝(样品4),并且靛蓝收率高达76.88%。抑菌实验结果表明:3种靛蓝粗提物和高纯度靛蓝均对黑曲霉、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制效果,且随着样品中靛蓝质量分数的增加,样品对3种菌的抑制效果均增加;其抑菌圈直径、最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)和半数抑菌浓度(IC_(50))分别为9.00~19.69 mm、1~512 mg/L、8~64 mg/L(黑曲霉)和0.6~448 mg/L,高纯度靛蓝对黑曲霉的抑制作用良好,其MIC、MBC和IC_(50)值分别为1、8和0.6 mg/L。

马蓝叶化学成分的分离与鉴定

目的:对马蓝Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek.叶的化学成分进行研究。方法:采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、反相高效液相制备等多种手段进行分离纯化,依据^(1)H-NMR、^(13)C-NMR、ESI-MS等对化合物进行结构鉴定。结果:从马蓝叶80%乙醇提取物中分离纯化得到13个化合物,分别鉴定为:松脂素(1)、5,7,4′-三羟基-6-甲氧基黄酮(2)、吲哚-3-甲酸甲酯(3)、1H-吲哚-3-羧酸(4)、3-(2-hydroxyethyl)quinazolin-4(3H)-one(5)、3-(2-hydroxyethyl)quinazoline-2,4(1H,3H)-dione(6)、脱氢地芰普内酯(7)、异黑麦草内酯(8)、去氢催吐萝芙木醇(9)、原儿茶酸甲酯(10)、咖啡酸甲酯(11)、2-氨基苯甲酸(12)、邻乙酰氨基苯甲酸(13)。结论:其中,化合物1、5~7、9、10、13为首次从马蓝属植物中分离得到。

板蓝根与南板蓝根及其混淆品的ITS2条形码鉴定

目的:利用ITS2条形码鉴定区分中药板蓝根与南板蓝根及其混淆品蓼蓝和大青。方法:提取4种中药基原植物基因组DNA扩增ITS2序列,隐马尔科夫模型HMMer进行序列注释,Clustal W法进行序列比对,K2P模型计算种内和种间遗传距离,邻接法构建进化树。结果:遗传距离分析显示,4个物种的最大种内遗传距离为0.034,最小种间遗传距离为0.347,最大种内遗传距离大于最小种间遗传距离。同时4个物种可以在进化树上明显区分开来。结论:ITS2序列可以用于板蓝根与南板蓝根及其混淆品蓼蓝和大青的分子鉴定,相较于传统鉴定方法,该方法更加高效与准确。

均匀设计优选南板蓝根多糖的提取工艺

目的:优选南板蓝根中多糖的提取工艺。方法:用均匀设计方法设计水提取工艺,以提取物中多糖含量为测定指标,考察提取温度,提取时间,料液比三个因素对有效成分多糖提取的影响。结果:最佳工艺为提取温度90℃,提取时间2h,料液比1∶50(g/ml),南板蓝根多糖的提取率为3·26%。在此条件下,北板蓝根多糖的提取率为12·76%。

板蓝根凝集素对小鼠胸腺发育的影响

目的 :实验研究板蓝根凝集素对小鼠胸腺组织发育和胸腺细胞增殖的作用。方法 :用生物化方法提取板蓝板凝集素 ,以昆明种小鼠为观察对象 ,用 0 .0 54mg/ kg/ d剂量板蓝根凝集素灌胃 ,连续 30天 ,采用组织切片方法 ,光学显微镜检测胸腺皮质与髓质细胞 ,并进行生物学统计。结果 :与对照组比较 ,实验组小鼠胸 /体比值 P<0 .0 5,胸腺皮质与髓质胸腺细胞密度 P<0 .0 1,细胞直径 >0 .0 5。结论 :实验证明板蓝根凝集素对小鼠胸腺的发育和胸腺细胞的增殖可能具有促进作用 。

不同生长时期对马蓝药效成分的影响

采用HPLC法对3个不同产地马蓝茎、叶中的3种中药效成分(靛玉红、靛蓝、色胺酮)在不同生长时期的含量进行了测定,结果表明:马蓝中的药效成分含量随着季节的变化而变化,其中靛玉红、靛蓝含量在11月份都达到最大值,是提取靛玉红和靛蓝的最佳时期;而适宜于色胺酮提取的最佳时期在10月份。因此,可以根据马蓝提取物质的不同选择其最佳收获期。

HPLC法测定马蓝根、茎、叶中靛玉红、靛蓝的含量

目的：建立HPLC法测定不同地区、不同采收期马蓝根、茎、叶中靛玉红、靛蓝的含量，为规范种植马蓝和重新确定南板蓝根药用部位提供基础研究资料。方法：用C18柱，以甲醇-水（75：25）为流动相，在289nm处测定。结果：靛玉红、靛蓝线性范围分别为3．875-23、25μg／ml、3．05-18．3μ／ml。回收率分别为96．9％，RSD：3．5％，n=5（靛玉红）；96．6％，RSD：2．8％，n=5（靛蓝）。结论：非花果期、花期、果期马蓝的根、茎、叶中靛玉红、靛蓝的含量依次递减；同一株马蓝根、茎、叶中靛玉红、靛蓝的含量依次递增。

酶法辅助提取南板蓝叶中靛玉红的工艺研究

[目的]研究酶法提取关键参数对南板蓝叶中靛玉红提取工艺的影响。[方法]采用HPLC测定靛玉红的含量,并考察酶用量、酶解pH值和酶解时间对提取率的影响,并优选出了最佳工艺条件。[结果]南板蓝叶中靛玉红酶法辅助提取的最佳工艺条件为:酶用量25 U/g,酶解pH值4.8,酶解时间6 h;在此条件下,靛玉红的Z值为7.02%。[结论]酶法辅助提取法适用于南板蓝叶中靛玉红的提取。

马蓝基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

以马蓝为研究材料,对马蓝基因组DNA的提取以及RAPD-PCR反应体系进行了优化。结果表明,在提取液中加入PVP和β-巯基乙醇去除酚类物质,采用高盐沉淀DNA和多次洗涤去除糖类,可以得到高质量的马蓝基因组DNA。电泳检测结果表明,所获得的DNA完整,无降解,完全可以满足RAPD等分子标记分析的需要。同时对马蓝RAPD-PCR反应体系中各个影响因素进行了优化,建立了适合马蓝RAPD分子标记的最佳反应体系,即20μl反应体系中含有1.25U TaqDNA聚合酶,0.25mmol/Ld NTP,2.5mmol/L Mg2+,50ng模板DNA,1.0μmol/L引物;反应程序中最佳退火温度为38℃。

马蓝叶与其易淆品路边青叶的叶形态-脉序图谱的鉴别特征

目的:寻找马蓝叶与其易淆品路边青叶的鉴别特征,建立有效的鉴别方法。方法:LMVP(叶形态-脉序图谱鉴别法),QAERM(定量分析评价鉴别中药品种真伪方法的可靠性方法)。结果:主要区别点:马蓝叶的叶基渐狭下延,干叶深暗蓝绿色、暗棕绿色,具梭状小点,无腺点或局部有小腺点,叶柄与中脉的界限不明显,最末二级脉的下方有三级脉从中脉发出;路边青的叶基不下延,干叶黄绿色、绿色、绿黄色、黄棕色,无梭状小点,密布腺点,叶柄与中脉的界限明显,最末二级脉的下方无三级脉从中脉发出。同时以上述6组区别点为指标,鉴别结果的正确性(AC)=98.5%～99.2%;重复性为符合率(ARO)=97.7%,一致性强度(Kappa)=0.95。结论:建立的"叶形态-脉序图谱鉴别法"可准确鉴别马蓝叶及易淆品路边青叶。操作简便、快速、价廉、可靠性强。

板蓝根提取物对林可霉素体外抑菌作用的影响

[目的]研究南板蓝根提取物对林可霉素注射液体外抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌作用的影响。[方法]采用水提醇沉法和60%乙醇回流提取法提取板蓝根,分别测定板蓝根提取物及林可霉素的抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC)。采用微量简化棋盘法,分别测定板蓝根提取物与林可霉素1∶1(V∶V)组合时的部分抑菌浓度指数(FIC),并以此来评价其抑菌作用。[结果]南板蓝根提取物与林可霉素均可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌,板蓝根提取物对林可霉素抑制这3种菌的作用分别为相加、相加和协同作用。[结论]南板蓝根提取物对林可霉素注射液体外抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均具有增强作用。

板蓝根和南板蓝根的显微结构比较

[目的]对板蓝根和南板蓝根进行显微结构的研究。[方法]应用数码显微技术对市售不同来源的板蓝根和南板蓝根进行了显微结构的比较与分析。[结果]在两者的显微结构上,板蓝根中多见网纹导管、单粒淀粉、复粒淀粉、石细胞;南板蓝根中多见孔纹导管、具细小纹孔的薄壁细胞、单粒淀粉、钟乳体,这表明板蓝根和南板蓝根的显微结构差异显著。[结论]该研究所建立的板蓝根和南板蓝根显微结构特征可用于2种中药材的质量评价,同时也为全面研究板蓝根和南板蓝根的质量标准提供了科学依据及方法学的保障。

栽培与野生马蓝叶及花粉粒的扫描电镜特征比较

比较栽培与野生马蓝叶表皮细胞和花粉粒扫描电镜的特征差异,探讨不同生长环境对马蓝的影响。分别采集栽培与野生马蓝的成龄叶片和成熟花粉粒,采用扫描电镜对叶片和花粉粒的表面形态特征进行对比分析。结果表明,栽培马蓝气孔器的极轴与赤道轴长度比为1.2(±0.2),野生品为1.4(±0.1),差异显著;栽培马蓝的气孔指数为36.0(±4.2)%,野生品为18.8(±3.6)%,差异极显著;栽培马蓝的腺鳞指数为7.8(±0.8)%,野生品为3.6(±0.9)%,差异极显著;而两者的钟乳体指数、花粉粒形态无显著差异。栽培与野生马蓝叶表皮细胞表面特征的差异,体现了植物结构与生态环境的相关性和适应性;两者花粉粒性状稳定,尚无孢粉学变异。

马蓝种质资源的RAPD分析

目的:探讨马蓝种质资源在分子水平上的遗传多样性。方法:利用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对收集到的不同居群马蓝资源进行分析。结果:从104条10个碱基的随机引物筛选出有差异的有效引物,筛选出的12条有效引物,扩增共获得422条DNA带,多态性程度为55.69%。聚类分析表明,马蓝种质资源的遗传差异与地理位置无密切联系,而与形态特征有一定联系,但并不十分紧密。结论:不同自然居群的马蓝资源在分子水平上存在着较明显的遗传差异。

果林间种模式下南板蓝株高及分枝生长规律研究

【目的】通过比较不同生长时期果林间种与单种模式下南板蓝的株高及分枝数的动态变化规律,阐明南板蓝的生长发育规律。【方法】分别将南板蓝种植于无遮荫种植地、蕉林地及柑橘林地中,每月定期测量南板蓝植株高度、每株各回分枝数及总分枝数,进行统计分析。【结果】南板蓝各模式组在不同生长时期的株高、各回分枝数及总分枝数均呈现上升趋势,但间种组各指标值均高于单种组。各种植组南板蓝的株高于5～11月份生长迅速,12月则生长缓慢;各组平均总分枝数5～8月份增长缓慢,9～12月份则增长加快。【结论】蕉林及柑橘林为南板蓝的生长提供了良好的荫蔽环境,间种模式比单种模式更利于南板蓝的生长。

马蓝次生代谢产物研究进展

马蓝是一种常用的道地药材,地下根茎与根常作为生产板蓝根及制剂的原料,具有多种药效功能。药用植物中有效成分大多数为植物次生代谢产物,但当前就马蓝次生代谢方面的研究却鲜有报道。本研究以植物的次生代谢为出发点,结合马蓝目前已经报道的药效成分研究现状,着重从酚类、萜类、含氮化合物3种次生代谢产物对马蓝次生代谢产物研究概况进行阐述,旨在为马蓝药效成分形成的分子机制研究提供理论基础,为进一步开展马蓝种质创新工作奠定基础。

南板蓝扦插育苗研究

【目的】研究不同扦插部位与不同扦插时间2种因素对南板蓝扦插育苗的影响,为南板蓝扦插育苗及进一步开展规范化种植(GAP)提供科学依据。【方法】选取1年生健壮且无病虫害的南板蓝植株顶部的嫩枝、中部的半老熟枝及下部的老熟枝3个部分,分别进行扦插,比较其扦插成活率及生根时间;选取1年生健壮无病虫害的植株嫩枝顶芽,分别于2月、7月、9月及11月进行扦插,比较其扦插成活率及生根时间。【结果】南板蓝扦插部位不同,育苗成活率及生根时间不同,育苗成活率由高到低的顺序是嫩枝>半老熟枝>老熟枝,生根时间由短至长的顺序依次为嫩枝<半老熟枝<老熟枝;在不同扦插时间,育苗成活率由高到低的顺序依次为2月>9月>11月>7月,生根时间由短至长的顺序依次为7月<2月<9月<11月。【结论】南板蓝扦插枝最好选择嫩枝及半老熟枝,扦插时间最适宜在春季及秋季。

板兰根中微量元素的研究

用原子吸收法测定不同产地板兰根中 K、Ca、Mg、Zn、Fe、Cu、Mn、Pb的含量 ,对测定方法进行了研究 ,确定的方法用于样品测定 ,回收率均在 92 %以上 ,相对标准偏差约在

板蓝根药材及制剂的质量研究概况

综述了板蓝根药材及制剂质量的研究概况 ,包括 :分别以靛蓝、靛玉红 ,多糖和氨基酸、有机酸作为有效成分的研究和板蓝根质量可控性方法的探讨。