甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的表达及响应面法优化发酵培养基

根据毕赤酵母密码子偏好,人工合成了单链甜蛋白Monellin基因,构建了胞内表达载体pPICZA-Mon,重组载体经Sac I线性化后,电击转入毕赤酵母GSll5,转化子经PCR分析鉴定后通过甲醇诱导实现了甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的胞内表达。采用Design Expert 7.0软件,利用响应面法对毕赤酵母盐培养基进行优化。首先用Plackett-Burman方法研究发酵培养基各成分对响应值的影响,结果表明酵母提取物、硫酸钙和磷酸缓冲液为3个主要因素;利用最陡爬坡法逼近最大响应区域;最后通过中心组合设计和响应面分析得到最优培养基组成为0.6%酵母提取物,0.03%硫酸钙,0.45%硫酸镁,4%甘油,1.25%硫酸铵,7.7%100mmol/L磷酸缓冲液(pH值为6.0)。在优化培养基条件下,工程菌生物量增加0.5倍,蛋白表达量提高近60%。

乳糖酶突变体库的构建及高活性突变体的快速筛选

构建了亮白曲霉来源的β-半乳糖苷酶活性中心的第219位丝氨酸的毕赤酵母饱和突变体库以筛选水解活性提高的乳糖酶。另外，通过以毕赤酵母发酵基础盐诱导培养基代替传统的BMMY培养基来诱导表达β-半乳糖苷酶和其突变体。结果表明，诱导时间在48～60h且粗酶液中总蛋白量在0．2～0．8mg／mL时，各乳糖酶的活力均高于其在BMMY培养基中的活力；各乳糖酶的比活力在此阶段保持相对稳定，且与纯化后的酶比活力呈正相关，即各乳糖酶的比活力高低可以粗酶液中乳糖酶的比活力来相对定量。在此基础上，利用高通量的48孔培养板创建了一种简便、高通量从B一半乳糖苷酶突变体库中筛选高水解活力乳糖酶的方法，并应用该方法快速地从突变体库中筛选到3个水解活力显著提高的突变体S-38、S-35和S-1，比活力分别提高了10．3％，9．2％和6％，高通量的筛选方法是定向进化技术中的重要环节，为其顺利开展奠定了基础。

响应面法优化产XRN1蛋白发酵培养基

应用Plackett-Burman(PB)设计法对影响XRN1蛋白表达的发酵培养基组分进行优化,选取的8个相关因子为酵母提取物、硫酸钙、MgSO4.7H2O、甘油、硫酸钾、磷酸、硫酸铵和氢氧化钾。统计分析表明,影响XRN1蛋白表达的关键因子为酵母提取物、硫酸镁和硫酸钾。在进行最陡爬坡试验逼近3个关键因素的最大响应区域的基础上,采用Box-Behnken Design法对发酵培养基组分进行优化,通过响应面法分析最佳条件为酵母提取物0.45%、硫酸镁0.38%和硫酸钾1.4%。在最佳培养条件下,工程菌生物量增加约0.5倍,蛋白表达量提高近40%。