不同毛色巴什拜羊皮肤组织中10个候选基因表达水平分析

为探讨可能影响动物毛色的10个候选基因(TCF25、TYR、TYRP1、ASIP、KIT、MITF、EDNRB、SLC7A11、MC1R和DCT)与巴什拜羊毛色的关系,利用实时荧光定量PCR技术对30只1周岁不同毛色(棕色、白色和黑色各10只)被毛的巴什拜羊皮肤组织中与毛色相关基因的mRNA表达量进行了研究,所有数据使用SPSS 23.0进行单因素方差分析。结果显示,在不同毛色被毛巴什拜羊皮肤中,TCF25、ASIP和EDNRB基因在白色被毛皮肤中的表达量均显著高于黑色和棕色被毛皮肤(P<0.05);TYR、TYRP1、DCT和MC1R基因在黑色被毛皮肤中的表达量均显著高于白色和棕色被毛皮肤(P<0.05);MITF基因在棕色被毛皮肤中的表达量显著高于白色和黑色被毛皮肤(P<0.05),而KIT和SLC7A11基因在不同毛色皮肤组织中均无显著差异(P>0.05)。综上可知,TCF25和ASIP基因主要与巴什拜羊白色被毛性状相关,TYR、TYRP1、DCT和MC1R主要与巴什拜羊黑色被毛性状相关,而MITF和EDNRB基因参与调控巴什拜羊棕色和白色被毛性状的具体作用机制还有待进一步探究。

oar-miR-133的表达对巴什拜羊骨骼肌细胞增殖和分化的影响

以巴什拜羊为对象,初步研究oar-miR-133的表达与巴什拜羊骨骼肌发育的关系。结果表明,oar-miR-133在巴什拜羊胎儿期第100天的骨骼肌和心肌中高表达;在巴什拜羊骨骼肌发育的不同阶段,oar-miR-133的表达量有明显的变化,在胎儿期的第100天和初生当天前后,骨骼肌中oar-miR-133的表达量均出现上调;当巴什拜羊骨骼肌卫星细胞处于增殖状态时,oar-miR-133表达量较低,而当骨骼肌卫星细胞处于诱导分化状态时,oar-miR-133表达量迅速升高,显著高于增殖状态(P<0.05);当骨骼肌卫星细胞中的oar-miR-133表达水平升高时,骨骼肌卫星细胞几乎停止增殖,细胞有相互融合转化为肌管的趋势,同时细胞内可检测到细胞分化的标志基因MyHC基因的表达;生物信息学分析共预测到96个oar-miR-133的靶基因,GO分析及KEGG信号通路分析结果表明,这些基因在细胞内通过参与一些重要的信号通路而发挥其生物学功能。

盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白对体外绵羊肺炎支原体感染的影响

为研究盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白对体外绵羊肺炎支原体感染的影响,首先分离试验羊的淋巴细胞,分别将盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白和绵羊肺炎支原体加入体外培养的淋巴细胞中共同孵育,利用real-time PCR技术检测肺炎支原体16SrRNA的表达水平。结果表明,体外淋巴细胞与绵羊肺炎支原体、重组ISG15蛋白共培养12h到96h,盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05),而杂交羊重组ISG15蛋白组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平与对照组差异不显著(P>0.05)。说明盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白在体外可对绵羊肺炎支原体起到抑制作用。

巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

【目的】为了深入挖掘巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因,为最终阐明巴什拜羊优良肉质性状形成的分子调控机制奠定基础,同时为巴什拜羊的持续选育提供理论依据。【方法】分别采集了巴什拜羊胎儿期40,50,60,80,100和120 d,以及出生当天,出生后30,60和90 d共计10个不同发育阶段的骨骼肌组织,分别利用胎儿期6个阶段的混合mRNA和出生后4个阶段的混合mRNA构建了胎儿期和出生后骨骼肌中miR-486调控靶基因的cDNA文库,并利用高通量测序技术对cDNA文库中的靶基因信息进行了深入挖掘。在对所得候选靶基因功能分析的基础上,选择10个候选靶基因,使用qRT-PCR检测其在巴什拜羊上述10个不同发育阶段骨骼肌中表达量的变化,结合课题组前期获得的miR-486在巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中的表达规律,对其靶向调控关系及生物学功能进行初步验证和分析。进而选择其中的4个候选靶基因使用荧光素酶报告载体试验和巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验最终确认其靶向调控关系。【结果】通过对两个cDNA文库高通量测序数据的分析,胎儿期和出生后分别获得了123个和118个miR-486的靶基因,因其靶向调控关系未经实验验证,故暂称为候选靶基因。其中有96个为两个阶段共表达的候选靶基因,其余27个和22个分别为胎儿期和出生后骨骼肌中特异表达的候选靶基因。GO和KEGG分析结果表明所得候选靶基因显著富集于与肌肉分化和肌纤维发育相关的代谢和信号转导通路,诸如PI3k-Akt、MAPK、Wnt、Adherens junction和Regulation of actin cytoskeleton等。qRT-PCR检测结果表明所选10个候选靶基因在不同发育阶段巴什拜羊骨骼肌中均有表达,但其表达变化规律有所不同。PTEN、Foxo1、Dock3、PAX7、IGF1R、PIK3I1和FBN1在胎儿期巴什拜羊骨骼肌中呈高表达,出生后其表达量显著下调,而OLFM4的表达量则呈相反的变化趋势,ARHGAP5和PDCD4在胎儿期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表达量未见显著变化。对其中4个候选靶基因的进一步试验验证,双荧光素酶报告载体试验结果表明,miR-486可以高效结合在其候选靶基因PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的靶位点上,进而极显著抑制其后萤火虫荧光素酶的活性;巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验结果亦表明miR-486可以显著下调上述4个候选靶基因的mRNA水平,抑制其生物学功能。所以可以确证在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向调控PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的表达。【结论】对巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因进行了深入挖掘,全面解析了miR-486及其靶基因在巴什拜羊骨骼肌发育过程中参与的生物学过程和信号通路,所得候选靶基因数据可靠性高,可为阐明巴什拜羊优良肉质性状的分子调控机制奠定基础。

巴什拜羊肉不同部位的品质特性分析

【目的】研究巴什拜羊不同分割部位肉的理化性质,为建立羊肉品质评价标准的提供参考。【方法】选用6～9月龄的巴什拜羊17只,取宰后24 h的肩肌、臀肌和背最长肌,对其常规营养成分、解冻滴水损失、熟肉率、pH值、系水力、肉色、剪切力、胶原蛋白及溶解度、结缔组织滤渣和肌原纤维断裂指数(MFI)进行测定。【结果】在不同部位间,肌肉的粗蛋白、不溶性胶原蛋白、pH值、肉色度值和系水力有极显著差异(P<0.01);总胶原蛋白含量、MFI、肉色L*值和b*值、剪切力有显著差异(P<0.05)。肌肉的剪切力与熟肉率、胶原蛋白含量、胶原蛋白溶解度、结缔组织滤渣含量和MFI之间有较高的相关性;肉色几乎与各项肉质指标呈正相关,系水力呈负相关;pH值与粗脂肪、系水力呈正相关,与解冻滴水损失、水分和胶原蛋白含量呈负相关。【结论】部位因素对羊肉的粗蛋白、胶原蛋白含量、MFI、pH值、肉色、系水力和剪切力的影响较大。背最长肌的粗蛋白、胶原蛋白含量、色度值、熟肉率和MFI较高,水分含量和剪切力较低,具有肉色鲜艳、肉质嫩等特点。不同部位羊肉理化性质与品质特性之间存在着复杂的内在联系。

巴什拜羊微卫星标记多态性及其与生长指标关联性分析

【目的】以巴什拜羊为研究材料,通过分析微卫星DNA座位的基因型,并与生长性状进行相关分析,以寻找影响巴什拜羊生长性状的微卫星标记,为分子标记辅助选择提供依据。【方法】从GenBank数据库查询绵羊、山羊的微卫星座位,根据微卫星选择标准选择符合要求的10个微卫星标记,对巴什拜羊189个个体基因组DNA进行检测,采用最小二乘方法分析微卫星座位与生长指标的关联效应。【结果】10个微卫星标记共检测到110个等位基因,平均每个座位等位基因数为11个,平均多态信息含量为0.7914,平均杂合度为0.8149;10个微卫星座位中有8个微卫星座位与巴什拜羊体重、体尺等5项生长指标有显著和极显著的关联性,特别是基因座BM415与体重、体尺指标均呈极显著相关(P<0.01),多重比较结果显示8个微卫星座位都存在优势基因型。【结论】发现了巴什拜羊群体生长指标具有显著效应,多态性较高的微卫星基因座,为开展巴什拜羊生长指标的分子标记辅助育种提供了有价值的遗传标记。

巴什拜羊与其杂交羊对绵羊肺炎支原体感染的比较

为了比较巴什拜羊与其杂交羊对绵羊肺炎支原体(MO)感染的差异,将6只巴什拜羊和6只杂交羊人工感染MO,分别观察其临床症状和病理解剖变化,用ELISA方法分别检测血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的浓度,制作肺部组织切片观察组织病理学变化,并进行组织病理学评分。结果显示,感染后杂交羊比巴什拜羊表现出更严重的、典型的支原体肺炎的临床症状和病理剖检变化。组织病理学评分结果显示,杂交羊的评分显著高于巴什拜羊。相关细胞因子检测结果显示,杂交羊血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的浓度均显著高于巴什拜羊。结果表明,巴氏拜羊对MO感染具有一定的抗性,而杂交羊对MO较易感。

巴什拜羊瘦肉型新品系的培育及其生产性能分析

【目的】培育瘦肉型巴什拜羊新品系。【方法】纯巴什拜羊及其野生盘羊杂交培育的瘦肉型巴什拜羊新品系21的产肉性能数量性状指标、不同饲养季节的肉成分;同时,对体型外貌的遗传变异也进行了测量对比。【结果】两者在产肉性能上相差不大,但小尾型巴什拜羊新品系总脂肪比纯巴什拜羊减少3 910 g,瘦肉增加1 500 g,大腿肌厚和腰肌厚度各增厚0.5 cm,背部脂肪层减薄1 cm,腰部脂肪层减薄1.5 cm,脂臀减少85.3%,瘦肉增加14.2%,不同季节肉成分中总蛋白含量变化不大,但总脂肪和胆固醇含量变化幅度较大。【结论】新品系的体型野生基因占优势,毛质和毛色巴什拜羊占优势。

野生盘羊×巴什拜羊回交二代的脂尾形态变异分析

试验旨在研究野生盘羊×巴什拜羊回交二代的脂尾形态特征以及脂尾大小对体尺指数的影响。以216只饲养条件相同、体况良好的75日龄野生盘羊×巴什拜羊回交二代为研究对象,计算脂尾性状的变异系数,再根据脂尾性状采用R语言K-mean聚类分析方法对野生盘羊×巴什拜羊回交二代进行分析,研究脂尾的分离分化情况,并用SPSS 19.0对回交二代各类型脂尾羊的7个体重体尺指数(体重、体长指数、胸围指数、管围指数、体躯指数、肢长指数和胸指数)进行差异比较分析。结果发现,根据聚类分析结果可将野生盘羊×巴什拜羊回交二代分为4个类型:小尾型、中尾型、大尾型和肥尾型;肥尾型体长指数极显著大于小尾型(P<0.01),大尾型体躯指数极显著大于小尾型(P<0.01),大尾型和肥尾型胸围指数、胸指数极显著大于小尾型(P<0.01),各尾型间的体重、管围指数、肢长指数差异不显著(P>0.05)。综合以上试验结果,回交二代的脂尾出现了性状分离,脂尾越大其体型越大,但体重无明显变化;结合野生盘羊与巴什拜羊的体型外貌特征及生产性能的特点,大尾型和肥尾型在体型上更趋近于巴什拜羊,小尾型则在尾型上更趋近于野生盘羊。

巴什拜羊群体双肌基因基因型检测

【目的】通过对巴什拜羊SNPCLPG的分子检测,期望发现CLPG基因型种羊,为今后选育肉用性状更优异的新品系奠定基础。【方法】绵羊的双肌臀(Callipyge,CLPG)基因表型为后臀肌肉增大近30%,是由位于绵羊18号染色体GTL2基因上游32.8 kb处1个A→G的单核苷酸多态性(SNP)标记(命名SNPCLPG)突变所产生的。为此,选择设计合成了1对引物,采用聚合酶链式反应一单链构象多态性(PCR—SSCP)方法,以巴什拜羊作为研究样本,进行了SNPCLPG位点的PCR检测。【结果】获得了预期的扩增片段,并检测到了基因多态性,但未检测到CLPG基因型特征的SNPCLPG突变(A→G)。【结论】被检测的巴什拜羊群体中该区域没有发现A→G的单核苷酸多态性标记突变。

LEF1基因在巴什拜羊不同毛色皮肤组织中的DNA甲基化及mRNA表达水平分析

【目的】分析LEF1基因在红棕色与青灰色巴什拜羊皮肤组织中DNA甲基化与mRNA的表达水平。【方法】运用BSP(亚硫酸盐修饰后测序PCR)与RT-RCR(实时荧光定量PCR),检测不同毛色巴什拜羊皮肤组织LEF1基因启动子区的甲基化水平与mRNA表达量。【结果】在红棕色巴什拜羊皮肤组织中的LEF1基因启动子区的甲基化水平高于青灰色的甲基化水平,且二者甲基化CpG位点不同,二者呈显著的负相关(P<0.05)。【结论】DNA甲基化水平对红棕色与青灰色巴什拜羊的毛色形成具有调节作用,可作为一个候选的巴什拜羊毛色遗传标记。

巴什拜羊A-FABP、PBDC1基因多态性及其与巴什拜羊生长性状的相关分析

本试验旨在研究脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein,A-FABP)、多糖生物合成域1蛋白(polysaccharide biosynthesis domain containing)基因在巴什拜羊中的多态性及其与生长性状的关系,探寻可用于巴什拜羊选育的分子遗传标记。试验以随机采取的120只巴什拜羊个体的血样作为试验材料,运用PCR-SSCP和DNA测序等技术对120只新疆巴什拜羊个体的A-FABP、PBDC1基因进行遗传多态性分析,统计基因和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态指标,分析A-FABP、PBDC1基因不同基因型与体高、体重、体斜长、胸围、管围等生长性状的关联性。结果表明A-FABP、PBDC1基因的外显子部分均存在多态性,多态性检验均存在2种基因型,测序分析表明A-FABP基因在外显子2的3159bp处存在G到A的突变,且该突变为同义突变,PBDC1基因在第1外显子170bp处发生A碱基缺失,使苏氨酸产生移码突变。关联分析可知A-FABP基因的GA型个体的胸围、体重、体长均显著高于GG型个体(P<0.05)。PBDC1基因的AB型个体的体重和体长均显著高于AA型个体(P<0.05)。巴什拜羊A-FABP、PBDC1基因存在的突变位点有可能作为一种遗传标记。

野生盘羊与巴什拜羊第二代杂种羔羊生长发育规律的研究

对野生盘羊与巴什拜羊第二代杂种羔羊生长发育进行测定,通过对第二代杂种羔羊初生前的生长发育、哺乳期的生长发育测定,并且绘制了累积生长、绝对生长和相对生长曲线图。计算分析生长发育的速度、强度等指标,并与纯巴什拜羔羊比较。测定结果表明:第二代杂种羔羊在胚胎期四肢生长强度比躯体强,这一点继承了盘羊的遗传特性;从初生到断奶期间躯体的生长速度和强度较好,这方面继承了巴什拜羊早期生长发育快的遗传特征,但在体尺指标和外部特征上野生基因占优势,为今后巴什拜羊与野生盘羊杂交改良工作提供科学依据。

巴什拜羊骨骼肌卫星细胞分离培养及诱导分化

为了获得巴什拜羊骨骼肌卫星细胞,本研究采集出生1日龄巴什拜羔羊后肢骨骼肌组织,采用两步酶消化法结合差速贴壁法分离纯化巴什拜羊骨骼肌卫星细胞,并对分离获得的骨骼肌卫星细胞进行了鉴定、传代培养及诱导分化等研究。结果表明,本研究采用的分离纯化方法可以高效获得巴什拜羊骨骼肌卫星细胞,RT-PCR检测结果表明骨骼肌卫星细胞标志性基因pax7、Myf5、MyoD、desmin和c-Met均呈阳性表达。获得的骨骼肌卫星细胞具有较强的增殖能力,连续传代12代,细胞的形态仍保持正常,且细胞的克隆形成率仍保持在50%以上,但是当细胞传代至第18代时,逐渐表现出较为明显的衰退。细胞的生长符合典型的"S"型生长曲线,且第2代和第8代细胞的生长曲线没有明显的差异,至第14代时细胞的增殖速度逐渐降低。采用低浓度马血清培养体系,可成功诱导巴什拜羊骨骼肌卫星细胞向肌管方向分化,诱导培养至第5天时,骨骼肌卫星细胞分化标志基因MyHC呈阳性表达。由此得出结论,本研究采用的骨骼肌卫星细胞分离纯化体系高效、可靠,可以满足较高纯度巴什拜羊骨骼肌卫星细胞的分离培养。

绵羊睾丸发育相关基因在不同组织中的表达差异

本研究旨在筛选与绵羊睾丸发育的相关基因,检测其在绵羊同品种不同组织及不同品种睾丸组织中表达水平的差异,从而为研究这些基因在绵羊睾丸发育中的作用提供科学依据。以阿勒泰羊和巴什拜羊为材料,采用RT-qPCR技术探究其差异性表达。结果显示,筛选出的基因DGCR6L、DDX24、ATP1A4、GPS2、PITRM1、KIF20B和Artn在阿勒泰羊附睾组织中高度表达,在巴什拜羊上除了GPS2和Artn在睾丸上高度表达,其余5个基因均在附睾组织中表达量最高。初步证明7个基因影响绵羊睾丸发育,对提高公羊繁殖力、为睾丸发育不完全综合征等疾病的遗传机制提供数据参考,同时为牛羊等优秀种公畜的早期选育提供参考依据。