灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能

【目的】明确灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能,为阐明该基因调控灰葡萄孢生长、发育和致病的分子机理奠定基础,并为灰霉病的防治提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法,对BcKMO及其编码产物进行分析。扩增BcKMO的编码区,与pBARKS1-eGFP载体连接,构建基因的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP;利用PEG介导的原生质体转化方法,转化BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183的原生质体;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术,对所获得转化子进行鉴定;对野生型菌株BC22、突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的表型(菌落形态、菌丝形态、生长速度、产孢量等)和致病力进行分析。【结果】BcKMO编码犬尿氨酸单氧酶(kynurenine 3-monooxygenase,KMO),含有单氧酶FAD的保守结构域和4个类似芳香环羟化酶(Aromatic-ring hydroxylase-like)的基序,与核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的Rossmann卷曲NAD(P)(+)-结合蛋白(Rossmann-fold NAD(P)(+)-binding proteins,gi156049701)和从线嘴壳(Ophiostoma piceae)的FAD依赖性氧化还原酶(FAD-dependent oxidoreductase,gi512192943)同源性较高。成功构建了BcKMO的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP,利用PEG介导的转化方法,转化突变体BCG183的原生质体,获得了草胺膦抗性的转化子;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术鉴定转化子,获得了BcKMO的回复突变体BCG183/BcKMO。对突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的表型进行了分析,发现BCG183突变体的生长速率减慢,不产生分生孢子和菌核,菌丝纤细;回复突变体和野生型菌株的生长速率、菌丝形态基本一致,均产生分生孢子和菌核。致病力分析发现,BCG183突变体在芸豆叶片和黄瓜叶片上的致病力均较野生型和回复突变体明显增强。【结论】灰葡萄孢BcKMO正调控病菌的生长、发育,负调控病菌的致病力。

灰葡萄孢犬尿氨酸单氧酶基因BcKMO调控病菌致病力的机制分析

【目的】揭示灰葡萄孢犬尿氨酸单氧酶基因BcKMO(kynurenine 3-monooxygenase)调控病菌致病力的机制,阐明灰葡萄孢致病的分子机理。【方法】利用DNS和Hoffman方法,对BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复突变体(BCG183/BcKMO)的多聚半乳糖醛酸酶(PMG)、果胶酶(PG)、纤维素酶(Cx)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)和果胶甲基反式消除酶(PMTE)的活性进行分析;提取灰葡萄孢野生型和BCG183、BCG183/BcKMO突变体的粗毒素并进行生物活性测定;利用溴百里酚蓝显色试验,对突变体BCG183和BCG183/BcKMO的产酸能力进行分析;利用洋葱表皮穿透试验,检测突变体BCG183和BCG183/BcKMO的穿透能力;利用real-time PCR技术,检测突变体BCG183和BCG183/BcKMO中已知致病相关基因腺苷酸环化酶编码基因Bac、异源三聚体G-蛋白G?亚基基因Bcg2和Bcg3、蛋白激酶调节亚基基因PkaR、MAP激酶编码基因Bmp1和Sak1、MAP激酶Bmp3和BcSak1下游的靶基因Bcreg1、TCHK-MAPK信号途径基因Bos1、亲环蛋白A编码基因Bcp1、小G蛋白基因Ras2、多聚半乳糖醛酸酶基因Bcpg1和超氧化物歧化酶基因Sod1的表达水平。【结果】突变体BCG183中的PMG和PG的酶活性较野生型和回复突变体明显增强,CX、PGTE和PMTE的酶活性与野生型和回复突变体没有明显差别;突变体BCG183的毒素活性较野生型和回复突变体明显增强;突变体BCG183的产酸能力较野生型和回复突变体明显减弱;突变体BCG183能够穿透洋葱表皮,在培养基上形成菌落,与野生型和回复突变体没有明显差别;突变体BCG183中已知致病相关基因Bac、Bcg2、Bcg3、PkaR、Bmp1、Sak1、Bcreg1、Bos1、Bcp1、Ras2、Bcpg1和Sod1的表达水平明显强于野生型和回复突变体。【结论】灰葡萄孢BcKMO通过调控病菌的胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力、致病相关基因的表达而影响病菌的致病力。

灰葡萄孢BcKMO基因的原核表达分析

为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与GST标签蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小约71 k Da。SDS-PAGE分析表明,该蛋白在0.2 mmol/L IPTG诱导12 h时高效表达;Western Blot结果发现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明Bc KMO基因的体外诱导表达成功。

灰葡萄孢致病基因BcKMO与病菌MAPK信号途径的关系

为明确灰葡萄孢致病基因BcKMO与病菌MAPK信号途径之间的关系,利用MAPK信号途径特异性的抑制剂U0126处理灰葡萄孢野生型菌株BC22、BcKMO基因的T-DNA插入突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO。结果发现,突变体BCG183对抑制剂U0126不敏感,受抑制的程度显著低于野生型和回复突变体。对BcKMO基因与MAPK信号途径关键基因bmp1和bmp3的表达规律进行分析,结果发现,BcKMO与bmp3均是在7 d的菌丝和菌核中表达水平较高,BcKMO与bmp1、bmp3基因均是在含蔗糖和果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高。利用Real-time PCR技术,检测BcKMO基因突变对bmp1、bmp3基因表达的影响以及bmp1、bmp3基因突变对BcKMO基因表达的影响,结果发现,突变体BCG183中bmp1的表达水平均显著高于野生型和回复突变体,bmp3的表达水平显著低于野生型和回复突变体; bmp1的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平显著高于野生型,而bmp3基因的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平显著低于野生型。结果表明,BcKMO基因负调控bmp1的表达,正调控bmp3的表达;而bmp1负调控BcKMO基因的表达,bmp3正调控BcKMO基因的表达。研究结果可为阐明灰葡萄孢BcKMO基因调控病菌生长、发育和致病力的机制奠定基础。

灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径的关系

【目的】明确灰葡萄孢(Botrytis cinerea)犬尿氨酸单加氧酶基因Bc KMO与病菌c AMP信号途径之间的关系,为进一步阐明Bc KMO调控灰葡萄孢生长、发育和致病力的分子机制打下基础。【方法】利用c AMP信号途径特异性抑制剂SQ22536,检测灰葡萄孢野生型BC22、Bc KMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复菌株BCG183/Bc KMO对c AMP信号途径特异性抑制剂的敏感性;分别提取灰葡萄孢野生型BC22、突变体BCG183和回复菌株BCG183/Bc KMO中的c AMP,利用HPLC检测各菌株中c AMP的含量;利用real-time PCR技术检测Bc KMO与c AMP信号途径中c AMP依赖的蛋白激酶(PKA)的催化亚基基因pka1和pka2、调节亚基基因pka R、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3在病菌不同发育阶段、组织部位以及培养条件下的表达规律;利用real-time PCR技术检测Bc KMO突变体中c AMP信号途径关键基因pka1、pka2、pka R、bcg2、bcg3的表达水平;利用real-time PCR技术检测c AMP信号途径关键基因pka1、pka2、pka R、bcg2、bcg3的RNAi突变中Bc KMO的表达水平。【结果】灰葡萄孢Bc KMO的T-DNA插入突变体BCG183对c AMP信号途径特异性抑制剂SQ22536不敏感,受抑制的程度明显低于野生型BC22和回复菌株BCG183/Bc KMO。Bc KMO的T-DNA插入突变体BCG183中c AMP含量明显低于野生型菌株BC22和回复菌株BCG183/Bc KMO。Bc KMO与c AMP信号途径中c AMP依赖的蛋白激酶(PKA)的催化亚基基因pka1、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3的表达规律基本一致,均为在7 d的菌丝和菌核中表达水平较高;此外,Bc KMO和c AMP信号途径关键基因pka1、pka2、pka R、bcg2、bcg3均为在含果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高。Bc KMO的T-DNA插入突变体BCG183中c AMP信号途径关键基因pka1、pka2、pka R、bcg2、bcg3的表达水平均明显高于野生型BC22和回复菌株BCG183/Bc KMO。pka1、bcg2的RNAi突变体中Bc KMO表达水平明显高于野生型,而pka2、pka R、bcg3的RNAi突变体中Bc KMO表达水平明显低于野生型。【结论】Bc KMO负调控c AMP信号途径关键基因pka1、pka2、pka R、bcg2、bcg3的表达;c AMP信号途径关键基因pka1、bcg2负调控Bc KMO的表达,而c AMP信号途径关键基因pka2、pka R、bcg3正调控Bc KMO的表达。